基于单克隆抗体的玉米赤霉烯酮检测方法研究

DOI ： 10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.022

食品研究与开发

Food Research And Development

2017年11月

第38卷第21期

基于单克隆抗体的玉米赤霉烯酮检测方法研究

刘琦，生威，李志，李诗洁，张燕，王硕*

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，教育部食品营养与安全重点实验室，天津300457)

摘要：建立一种检测谷物样品中玉米赤霉烯酮的酶联免疫分析方法。将玉米赤霉烯酮修饰嚴基制得半抗原，再与

钥孔嘁血蓝蛋白偶联，免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合与筛选，得到3株具有高亲和力和特异性的杂交瘤细胞，分 别为2[8、2〔7、6[11，重链类型均为^〇1，轻链类型均为〖&卩卩&。细胞株2[8分泌的抗体特异性较好，制备腹水得到单 克隆抗体用于后续实验。建立检测玉米赤霉烯酮的间接竟争酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA)方法，方法的灵敏度(IC50)为（0.13±0.02)ng/mL，检测限(ICJ为（0.02±0.01)ng/mL，在玉米和燕麦中的检出限

分别为2.4邮^8,4.0邮^8。加标回收率为82.80%~109.20%，变异系数为3.27%~15.38%。经高效液相色谱串联质谱 仪验证(R2=0.996 3)二者具有良好的相关性。

关键词：玉米赤霉烯酮；单克隆抗体；间接竞争酶联免疫吸附法；高效液相色谱-串联质谱法

Study on Immunoassay for the Detection of Zearaleone Based on Monoclonal Antibody

LIU Qi，SHENGWei，LI Zhi，LI Shi-jie，ZHANG Yan，WANG Shuo*

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education of China, College of Food Engineering and

Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Abstract ： The aim of this research was to develop an enzyme linked immunosorbent assay to detect zearalenone

in grain samples. Three hybridoma cells named 2E8,2C7,6E11 were obtained after cell fusion and filtering by immunizing Balb/c mouses with conjugate of ZEN and keyhole limpet hemocyanin. The subtypes of three mono­clonal antibody were identified with IgG1 for heavy chain and Kappa for light chain. The cell 2E8 was chosen for subsequent experiments. An indirect-competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was devel­oped for the detection of zearalenone with high specificity and affinity after optimizing. The half maximal in­hibitory concentration (IC50) was(0.13±0.02) ng/mL, the limit of detection (IC15) was (0.02±0.01) ng/mL while the the limits of detection are 2.4 ^g/kg, 4.0 ^g/kg for corn and oat with the recoveries from 82.80 % to 109.20 % and the coefficients of variation was between 3.27 % and 15.38 %. The method was confirmed by high perfor­mance liquid chromatography tandem mass spectrometry with a good correlation.

Key words： zearalenone; monoclonal antibody; indirect -competitive enzyme linked immunosorbent assay

(ic-ELISA); high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN)是由禾谷镰刀 菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌、粉红镰刀菌等产生的一 种真菌毒素[1]。ZEN具有雌激素活性，造成动物体内生 殖激素紊乱，严重影响动物的繁殖机能[2-5]。我国GB

基金项目“十二五”国家科技支撑计划（2013BAD18B11);国家国际 科技合作专项项目（2014DFR30350)

作者简介:刘琦(1992—),女(汉）,硕士，研究方向:食品安全检测。*通信作者:王硕(1969—),男，教授，博士生导师，研究方向:食品安 全和免疫学检测。

2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》 规定[6]:谷物及其制品中，ZEN限量为60 pg/kg。

目前，检测ZEN的方法主要有色谱法和免疫分析 法[7]。基于色谱检测的方法如高效液相色谱(High per­formance liquid chromatography，HPLC )[8-9]以及高效液 相色谱-质谱联用（Highperformanceliquidchromatog- raphy-Mass sepectrum，HPLC-MS)[1。-11]等方法具有准确 度好，灵敏度高、重复性好等优点，是目前应用于食品 中有害小分子物质检测的实验室确证方法。免疫分析

112

刘琦，等：基于单克隆抗体的玉米赤霉烯酮检测方法研究

标准与检测

法主要包括酶联免疫吸附法1]、胶体金免疫层析法[13-14] 以及免疫生物传感器技术[15-18],具有高特异性、灵敏 性，不需要贵重仪器，可以大大简化前处理过程，在现 场检验以及批量筛选中具有重要意义[19]。王元凯等[20] 制备ZEN单克隆抗体并建立一种间接竞争酶联免疫 吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方 法。方法的灵敏度为1.90pg/kg，检测限为0.051 pg/kg。 祭芳等[21]制备ZEN单克隆抗体，腹水效价大于lxlO^6, 抗体灵敏度为225 ng/mLaSun等[22]经过细胞融合，得到 四株特异识别玉米赤霉烯酮的单克隆抗体。选择最为 灵敏的细胞株 4A3-F9(IC50=1.115 ng/mL)进行 ELISA 方法的建立，方法回收率为91.30〜97.07 %。Pei等[23]通 过高通量酶联免疫分析对杂交瘤细胞进行筛选，制备 的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体灵敏度IC50=1.79 ng/g， 检测限为ICF0.1 ng/g，对玉米样品进行了测定，方法 回收率为80%~128%。

本研究使用单克隆抗体技术，得到抗玉米赤霉烯 酮的单克隆抗体，并建立一种用于检测谷物中玉米赤 霉烯酮的间接竞争ELISA方法。

1.4 方法

1.4.1人工抗原的合成

玉米赤霉烯酮半抗原的制备方法参照文献[24]并改 进，步骤如下：称取10 mg玉米赤霉烯酮于圆底烧瓶 中，加人200 pL甲醇使其溶解。加人20 mg羧甲基羟 胺（Carboxymethoxylamine，CMO)，1 mL 无水吡啶，氣 气保护下室温搅拌反应24 h，反应结束后50 °C真空干 燥除去吡啶，4 °C保存待用。

免疫抗原的制备参照方法1]并改进，步骤如下:称 取上述所得半抗原9.78 mg和EDC 14 mg，加人1 mL DMF溶液，搅拌并4 C活化过夜。将10 mg KLH溶于 2 mL碳酸氢钠缓冲液（130 mmol/L，pH=8.1 )，在冰浴中 逐滴加入活化产物，室温下反应2 h后在4 C下反应 过夜。将产物用憐酸盐缓冲液（phosphate buffercd saline，PBS)溶液透析72 h，测定其浓度并分装，冻存 于-20。C。包被抗原（Zearalenone-ovalbumin，ZEN-O- VA)的制备方法同免疫原。1.4.2 单克隆抗体的制备

将免疫原100 pg与等体积的弗式完全佐剂混合 均匀(加强免疫使用弗氏不完全佐剂)免疫动物。分别 于第2、3、4次免疫后8 d~10 d在小鼠尾动脉处取血， 采用间接竞争ELISA进行检测。冲刺免疫后取脾细胞 与Sp2/0融合，采用有限稀释法3次克隆化，得到能够 稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。采用辛酸-硫酸铵法 纯化单克隆抗体腹水，并使用亚型鉴定试剂盒对所产 抗体的亚型进行鉴定。1.4.3间接竞争ELISA方法

在37 C下，将100 pL的包被抗原（1 pg/孔）加人 到聚苯乙烯酶标板上，孵育3 h。弃去孔中液体，用 0.05 %吐温 20-憐酸盐缓冲液(phosphate bufferad sahne mith0.05%tween20，PBST)洗液洗板 3 次（250 pL/ 孔），拍干;使用0.5 %脱脂乳粉溶液(200 pL/孔)对微 孔进行封闭1 h，PBST洗液洗板3次；实验孔加入标 准品（50 pL/孔），对照孔加人等量的PBS，同时加人 用PBS缓冲液梯度稀释的抗血清（50 pL/孔），孵育 1 h，PBST洗液洗板4次；加人用PBS缓冲液稀释 10 000倍的羊抗鼠酶标二抗（100 pL/孔），孵育 30 min，PBST洗液洗板5次;加人底物液（100 pL/?L)， 反应15 min〜20 min；加人终止液(50 pL/孔)终止反应； 用酶标仪在双波长(450、650 nm)下，读取吸光值。1.4.4间接竞争ELISA方法标准曲线的绘制

设定ZEN标准品浓度值分别为10、3.33、1.11、 0.37、0.123、0.041、0.013 7、0.004 6、0 ng/mL。标准品浓 度为0时的吸光值设为B。，不同浓度标准品的吸光值 设为B，空白对照的吸光值设为B

空白

1材料与方法

1.1材料与试剂

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)标准品、钥孔嘁 血蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH )、弗氏完 全佐剂（Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐剂 (Freund's incomplete adjuvant)、N，N-二甲基甲酷胺 (N，N-Dimethylformamide，DMF)、1 -(3-二甲氣基丙 基）-3-乙基碳二亚胺（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC ):美国 Sigma 公 司；羧甲基羟胺、无水吡啶：法国阿法埃莎公司；Free DMEM培养基、胎牛血清、HAT、HT:美国GIB⑶公 司；MycoSep 226净化柱:美国Romer公司；甲醇(色谱 纯）:德国Merck公司;其他所有试剂均为国产分析纯。

玉米、燕麦样品购自天津某超市，经高效液相色 谱串联质谱分析为阴性样品。1.2仪器与设备

Mycosep226净化柱：美国Romer公司；酶标仪、 CO2细胞培养箱:美国Thermo公司;倒置显微镜：日本 NIKON公司；液相色谱串联三重四级杆质谱仪(配有 电喷雾离子源(ESI)和Agilent MassHunter工作站）:美 捷司。1.3实验动物与细胞株

实验动物为健康雌性BALB/c小鼠：北京军事医 学科学院;骨髓瘤细胞为Sp2/0细胞:天津科技大学教 育部食品营养与安全重点实验室保存。

，抑制率计算公

标准与检测

刘琦，等：基于单克隆抗体的玉米赤霉烯酮检测方法研究

113

式为：1-[(B-B空白)/(B〇-B空白）]x100%o以标准品浓度 为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准抑制曲线。1.4.5抗体特异性的测定

选择几种常见的真菌毒素以及玉米赤霉烯酮结 构类似物测定交叉反应来评价抗体特异性。交叉反应 率(cross-reactivity，CR %)计算公式如下：

样品处理方法参照文献^并改进，方法如下:准确 称取5 g谷物样品，粉碎后加入20 mL70 %甲醇-水溶 液，剧烈震荡2 min，10 000 r/min离心15 min，取上清 用PBS稀释后测定。向玉米样品中分别添加玉米赤霉 烯酮标准品5、10、20 pg/kg，向燕麦样品中分别添加 15、25、50 pg/kg,计算回收率以及变异系数。

高效液相色谱串联质谱法谷物样品处理方法：样品处理方法参照文献[26]并改进，方法如下:准确 称取2 g谷物样品，粉碎后加入10 mL70 %甲醇-水溶 液，剧烈震荡2 min，10 000 r/min离心15 min，使用 MycoSep226多功能净化柱进行净化。氮气吹干有机 溶剂，取1 mL甲醇复溶试管底部残渣，溶液经0.22 pm 有机相滤膜过滤后进行分析。加标回收方法同间接竞 争ELISA方法谷物样品处理方法，并比较两种方法的 相关性。

1.4.6甲醇含量对ELISA反应体系的影响

谷物样品的提取需要使用甲醇作为提取液。配制 浓度为〇%、1 %、5 %、10%、20%、40%的甲醇/?丑3溶 液作为样品稀释液进行间接竞争ELISA，考察有机试 剂含量对ELISA体系的影响。

1.4.7高效液相色谱串联质谱法的验证 1.4.7.1色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 液相色 谱柱(50 mmx2.1 mm，1.8 pm);流动相：甲醇：0.05 %氨 水=50 : 50(体积比）；载气流速0.2 mL/min，进样量1 ^[;柱温箱温度:25°€。1.4.7.2 质谱条件

电喷雾电离源(ESI-);碰撞能量25 V;毛细管电 压140 V;母离子m/z 317.36;子离子m/z 131.1;干燥气 温度:350 °C;干燥气流速:10 L/min。1.4.8实际样品测定

间接竞争ELISA方法谷物样品处理方法：

表1

2

结果与分析

2.1细胞筛选及亚型鉴定

对4只小鼠进行免疫，经测定均有免疫应答。小 鼠4经免疫后效价达到1 : 128 000,对100 ng/mL的 ZEN标准品抑制率达到83.2 %，因此选择小鼠4进行 细胞融合。本次细胞融合获得3株杂交瘤细胞。经测 定重链类型均为IgG1;轻链类型均为Kappa。纯化腹水 并进行特异性测定，结果见表1。

单克隆抗体特异性及亚型测定

Table 1 The sensitivity and isotype of monoclonal antibody

士制歲/從

/91.681.885.8

重链

IgG12.261.992.22

IgG2a0.1450.1010.112

IgG2b0.0860.0670.070

IgG30.1030.0680.080

IgA0.0830.0800.080

IgM0.1140.1060.120

Kappa0.4490.20.428

轻链

Lambda0.0780.0850.0

细胞株2E82C76E11

注:包被抗原包被量1 pg/孔;ZEN标准品浓度100 ng/mL。

2.2间接竞争ELISA方法标准曲线

选择细胞株2E8分泌的单克隆抗体建立间接竞 争ELISA方法。ELISA方法工作条件为:包被抗原包 被量为0.01 pg/孔，抗体稀释4万倍，米用0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液来稀释标准品，得到玉米赤霉烯 酮的间接竞争标准曲线如图1所示。方法灵敏度IC0= (0.13±0.02) ng/mL，检测限 IC15=(0.02±0.01) ng/mL。2.3抗体特异性测定

交叉反应测定结果见表2。制备的玉米赤霉烯酮 单克隆抗体与其他真菌毒素几乎无交叉，说明抗体的 特异性较好。与4种结构类似物均有交叉，与玉米赤

图1 ZEN间接竞争ELISA标准曲线 Fig.1 Standard curve of ZEN by ic-ELISA

霉酮交叉较小。由于此结构类似物是由玉米赤霉烯酮

114

表2

mycotoxin

真菌毒素玉米赤霉烯酮a-玉米赤霉烯醇P-玉米赤霉烯醇a-玉米赤霉醇P-玉米赤霉醇玉米赤霉酮赭曲霉毒素A黄曲霉毒素B1伏马毒素B1呕吐毒素T-2毒素

刘琦，等：基于单克隆抗体的玉米赤霉烯酮检测方法研究

标准与检测

抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体与其他真菌毒素的交叉反应

反应的灵敏度。尤其是当甲醇超过20 %时，灵敏性显 著降低。因此，当甲醇含量低于5 %时，可认为对 ELISA体系影响较小。2.5样品基质影响及消除

对样品提取液进行不同倍数的稀释，绘制标准曲 线，以确定能够消除基质影响的最适稀释倍数，结果 见图3。

Table 2 Cross-reactivity of anti-ZEN monoclonal antibody with

IC50( ng/mL)

0.130.180.0.760.2620.25>100>100>100>100>100

交叉反应率/%

10072.214.617.150.00.6<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

0.01 0.1 1 10

ZEN 浓度/(ng/mL)

代谢产生，且均有毒性，因此，本次制备的抗体可实现 对这4种结构类似物的检出。

2.4甲醇含量对间接竞争ELISA的影响

甲醇含量对间接竞争ELISA的影响结果见图2。

图3样品提取液稀释倍数对ELISA反应的影响

Fig.3 The influence of dilution multiple of sample extraction

buffer on ic-ELISA

由图3可知，玉米样品提取液稀释30倍，燕麦样

图2

甲醇含量对间接ELISA的影响

品提取液稀释50倍后进行测定可以基本消除基质影 响，且此时甲醇含量不超过5 %。2.6实际样品测定结果

样品测定结果见表3。

Fig.2 The influence of methanol on ic-ELISA

当甲醇含量低于5 %时，对ELISA反应影响较小。 甲醇含量大于5 %时影响抗原抗体反应，降低ELISA

表3

样品添加回收试验(n=3)

Table 3 Recovery test in samples (n=3)

添加浓度/ (^g/kg)

51020

燕麦

152550

检测浓度/(^g/kg)

5.46±0.849.14±0.6019.78±0.9712.43±1.0323.24±0.74.32±1.94

ELISA方法平均回收率±SD/%109.20±16.8091.40±6.0098.90±4.8582.80±6.8792.96±3.0488.±3.88

变异系数/%

15.386.5.908.293.274.38

检测浓度/(^g/kg)

4.82±0.4310.30±0.1619.96±0.3711.43±0.2324.47±0.36.44±0.

HPLC-MS/MS 方法平均回收率±SD/%

96.40±8.60103.00±1.6099.80±1.8576.20±1.5397.88±1.4492.88±1.28

变异系数/%

8.921.551.852.011.471.38

样品玉米

可知间接竞争ELISA方法的加标回收率在 82.80 %〜109.20 %之间，液相色谱串联质谱方法的加 标回收率在76.20 %〜103.00 %。经过比较二者线性相

关系数值R2为0.996 3，两种方法检测的结果较为一致，说明ELISA方法较为准确。根据样品的稀释倍数可以得出间接竞争ELISA方法在玉米和燕麦中的检

标准与检测

刘琦，等：基于单克隆抗体的玉米赤霉烯酮检测方法研究

national, 2011, 94(2):5-595

115

—

出限分别为 2.4 pg/kg，4.0 pg/kg。

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3结论

本研究经过细胞融合与筛选得到3株能够特异性分

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泌抗体的杂交瘤细胞，对玉米赤霉烯酮均具有高度特异 性。选择最优细胞株建立检测玉米赤霉烯酮的间接竞 争酶联免疫吸附(ELISA)方法。方法的灵敏度(IC»)为 (0.13±0.02) ng/mL，检测限(ICJ为（0.02±0.01) ng/mL， 在玉米和燕麦中的检出限分别为2.4 pg/kg，4.0 pg/kg。 经液相色谱串联质谱法验证二者相关性良好，方法操 作简单且灵敏，可用于检测多种谷物中的玉米赤霉烯 酮含量。

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