*CN101690736A*
(10)申请公布号 CN 101690736 A(43)申请公布日 2010.04.07
(12)发明专利申请
(21)申请号 200910169671.X(22)申请日 2009.08.31
(71)申请人北京农学院
地址102206 北京市昌平区回龙观镇北农路
7号(72)发明人吴国娟 马元元 张中文 杨明
郭玮(51)Int.Cl.
A61K 35/76(2006.01)A61P 31/14(2006.01)A61P 31/20(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 21/64(2006.01)G01N 33/543(2006.01)
(54)发明名称
PRRSV和PCV2共感染小鼠疾病模型(57)摘要
本发明公开了一种用于兽医传染病学、病理学和药理学研究领域，涉及非猪的猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环2型疾病模型动物的构建方法。本发明的特征在于，在经济常用的实验动物中，通过特定攻毒方法促使小鼠产生典型病变，并采用体重称量、病理切片制作、PCR检测和ELISA抗体检测方法来证实该疾病模型的成功构建，将为这两种病毒共感染相关体内实验研究做了进一步的铺垫，以及为药理实验研究奠定一定的基础。本发明的疾病模型稳定性高、操作简便、广泛实用。由于猪体试验周期长、费用高、阴性猪难于筛选，更重要的是在猪体本身并不能复制该病，因此，建立完善的小型动物感染模型，对疫苗免疫效果评价和病毒致病机理的研究都十分必要。CN 101690736 A权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 4 页
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权 利 要 求 书
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1.两种细胞系Marc-145、PK-15，购自于中国兽药监察所。
2.两种毒株PCV2和PRRSV，为本实验室保存毒株，TCID50＝106/mL。
3.一种清洁级6周龄昆明小鼠，由中国军事医学科学院兽医研究所实验动物中心提供[SCXK-(军)2007-004]。
4.权利要求3所述的小鼠，其特征在于，所述的小鼠能够感染PRRSV和PCV2两种病毒，而PRRSV和PCV2两种病毒分别用Marc-145、PK-15细胞培养。
5.四种能够检测小鼠感染PRRSV和PCV2的指标，它包括(1)体重变化测量(2)病理切片检测(3)PCR检测(4)ELISA抗体检测。
6.权利要求6所述的病理切片检测，其特征在于，所检测的组织包括肺脏、淋巴结、肝脏、脾脏。
7.权利要求5或6所述的一种PRRSV和PCV2共感染小鼠疾病模型的建立，其步骤包括：
1)培养Marc-145、PK-15细胞；
2)分别扩繁PRRSV和PCV2两种病毒；
3)给小鼠多途径分组接种PRRSV和PCV2细胞培养毒；4)攻毒前后称重记录，并做统计学分析；
5)采所检测组织和血清，制作石蜡切片和ELISA抗体检测；6)提取冻存检测组织的RNA，进行荧光定量PCR检测。
8.权利要求7所述的方法，在权利要求3所述的小鼠上建立共感染PRRSV和PCV2疾病模型能够成功。
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说 明 书
PRRSV和PCV2共感染小鼠疾病模型
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技术领域
本发明涉及非猪的猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环2型疾病动物模型的构建方
法，该构建方法的特征在于，在经济常用的实验动物中，通过特定方法促使小鼠产生典型病变，并采用不同方法检测疾病模型的成功构建，为进一步的临床和药理实验研究奠定基础。
[0001]
背景技术
[0002] 1病原简介
[0003] 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称猪繁殖与呼吸综合征，猪蓝耳病，迄今为止，蓝耳病仍然是当今养猪业危害最大的疾病之一。蓝耳病的危害不仅表现在疾病本身对猪造成的损伤引起的经济损失，而且还因为蓝耳病病毒是猪的主要钥匙病原，因而很多其它病原(PCV2、链球菌、APP和副猪嗜血杆菌等)因为感染蓝耳病而发生严重的继发或混合感染，导致很高的死亡率和持续的经济损失。本病主要引起母猪繁殖障碍，仔猪肺炎和断奶前后仔猪的死亡率增高，自1987年在美国，1990年在欧洲被发现后传播蔓延速度十分惊人，病毒分离和血清检查表明，PRRS现已传遍世界主要养猪国家。1995年，我国在北京郊区首次暴发了PRRS，1996年以来，国内一些单位进行的流行病学和血清学调查证明，我国大部分省市都已有此病，且血清阳性率都很高，但呈地方性流行特征。特别是2002年大有全国一片蓝的趋势。针对PRRS的现状，各国都已引起高度重视，近年来在流行病学，免疫学及致病机理，实验室诊断技术，综合防制等方面开展了大量的调查研究工作，PRRS的诊断与防制尤其成为当前兽医研究的一个热点。
[0004] 猪断奶后衰竭综合征(PMWS)的主要病原体，已被世界各国学者确认为圆环病毒(PCV2)本病最早发现于加拿大(1991)，1996年暴发该病，同时此病很快在美国、西班牙、英国、丹麦、德国、荷兰、比利时、立陶宛、奥地利和意大利发生。除上述国家外，近年来，日本、韩国、泰国、捷克、墨西哥、匈牙利、中国以及台湾地区均有此病发生和流行，另外PCV2与许多猪相关疾病的发生有关。除PMWS之外，PDNS(猪皮炎与肾炎综合征)、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关联的猪的疾病已在全世界范围内发生和流行，死亡率10-30％不等。较严重的地区，猪场在暴发本病时死淘率高达40％左右，其危害和造成的重大经济损失显而易见，现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为本病是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的重要的猪传染病。
[0005] 用PRRSV和PCV2作实验性共同感染，在实验猪的肺内发现的PCV2核酸或抗原量比单独PCV2感染要多。用PRRSV/PCV2共同感染的实地病例的肺作免疫组织化学检验时一致显现PCV2抗原，证实了PRRSV诱发PCV2增殖增加的实验观察。有力地证实PCV2在PRDC中的重要作用和加剧了PRRSV和PCV2共同感染的病症。在PMWS感染猪中，PCV2和PRRSV共同感染的比例很高，在美国高达20-60％。德国学者V.E.Ohlinger等对432个PMWS样品的检查结果表明PCV2与PRRS共同感染率高达
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75.9％。淋巴细胞缺失和淋巴组织的巨噬细胞浸润，是PMWS病猪的独特性病理损害和基本特征。
[0006] 2病原检测技术[0007] 2.1病毒分离
[0008] PRRSV可以在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAM)、特定的非洲绿猴肾细胞(Marc-145、CL2621等细胞)上复制，然而不是每种细胞系都适合PRRSV的生长，这也就是说，如果可能的话，需要用至少2种细胞系来进行病毒特定的分离培养。但分离欧洲株PRRSV只能用PAM细胞。PRRSV可以在多种临床样品中分离得到，其中包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃腺、肺、淋巴结、脾、胸腺、心、脑、肝、睾丸和精液等，其中血清和肺灌洗液最适合病毒分离。PRRSV在血清中存在比组织中稳定，而老龄动物由于病毒血症的时间短，则病毒在组织中存在的时间长。组织必须及时送检才能保证病毒分离的成功。样品的选择同时也要根据感染的阶段(急性感染期、康复期和持续感染期)，在急性感染期，选择血清、肺、肺灌洗液作为样品比较好，而持续感染的动物则选择口、鼻棉拭及肺灌洗液较好。对于迟发性流产和早产的病例，样品选择弱胎或哺乳仔猪要比木乃伊胎和流产胎儿好。虽然弱胎很可能有病毒血症，但其存在高滴度的母源抗体对病毒的分离有干扰作用。[0009] 2.2病毒抗原的检测
[0010] 冷冻组织切片荧光抗体检测和免疫组化可以在组织中检测病毒抗原，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。组织样品最好采集肺脏、脾脏、淋巴结、胸腺及扁桃体。冷冻切片直接或间接免疫荧光成本较低并且快速，样品的质量对冷冻组织切片荧光抗体检测的结果影响很大，组织应该取自最近死亡的动物而且要迅速冷冻。相比较而言，免疫组化法可以检测在福尔马林中保存的组织病毒，但费时费力。免疫组化法的敏感性比免疫荧光要高，但检测费用也相对较高。鉴别诊断可以根据检查PRRSV微观病变特征并与免疫组化法或免疫荧光配合检测。[0011] 2.3病毒RNA的检测
[0012] 反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)已经用于临床样品的检测。由于病毒不需要经细胞培养，而是检测病毒RNA，所以RT-PCR技术比病毒分离大大节省了时间，而且有着较高的特异性和敏感性，此项技术已广泛应用于PRRSV的鉴定和临床诊断，并在方法上不断改进和提高。RT-PCR技术扩增的目的片段主要是针对PRRSV的N蛋白基因，原因是PRRSV基因组中ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)中包括所有毒株保守的共同表位和区别于欧洲型的特异性表位。另外，还可针对病毒基因组的ORF6或ORF1，目前针对ORF1编码的病毒非结构蛋白2(Nsp2)的基因序列是否缺失，可以从临床采集的样品中区分是弱毒株感染还是高致病性的变异毒株感染所引起。精液、粪便等样品用传统方法不易检测，这样用RT-PCR的方法就非常有效，而且它还可以用于胎儿组织和腹水等低含毒量样品的检测。近年发展起来的实时荧光定量PCR检测技术与传统诊断方法比较具有很多突出的优点，如引物与探针可以大量合成并长期保存，检测速度快(仅需2h～4h)，结果准确，不易污染，敏感性更高(比常规RT-PCR高100倍)，可以区分不同的毒株亚型。在PRRSV的早期检测、预防控制、出入境检疫及基础研究中发挥着重要作用。套式RT-PCR技术也可以增强检测的敏感性，
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可以区分美洲型和欧洲型PRRSV。但以上两种检测技术需要更高的成本，在实用性方面不利于推广。根据样品的性质、样品采集、实验室技术水平及检测技术的差异，不同实验室RT-PCR技术的应用也会有所不同。因此，每个实验室要根据自身的条件和技术水平，建立起有自己特点RT-PCR的检测技术。
[0013] 应用核酸探针原位杂交技术和基因芯片技术检测PRRSV的RNA也日趋成熟，Chuch L制备了地高辛探针，成功建立了敏感荧光原位杂交技术，结果PRRSV核酸在巨噬细胞内明显可见，故认为该法对PRRSV常规临床诊断及病毒持续性感染研究有重要意义。高淑霞等报道将PRRSV、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的保守序列构建重组质粒制备探针，并将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维膜上并加以固定，制备低密度基因芯片。与RT-PCR方法相比，显示了较高的灵敏度。该方法的建立，为大批量快速诊断、普查猪病毒性繁殖障碍性疾病提供了有效的鉴别诊断手段，但鉴于成本因素，与实际应用还有一定的距离。[0014] 3PRRSV血清抗体检测
[0015] PRRSV特异性抗体的诊断方法主要有间接免疫荧光(indirect fluorescence assay，IFA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)、酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)、病毒中和试验(serum virus neutralization，SVN)和乳胶凝集试验(latex agglutination test，LAT)。其中IFA、SVN和ELISA在美洲诊断实验室应用较多，而欧洲主要用IPMA检测PRRSV抗体。血清学试验的结果受到检测用分离病毒与感染猪病毒相关性的影响。[0016] 3.1间接免疫荧光试验
[0017] 间接免疫荧光试验(IFA)特异性可达99％，敏感性不是很清楚。IFA可以确定抗体的滴度。参照试验起始时血清的稀释度，抗体滴度达到16或20的可以判为阳性。在动物感染后2月～3月IFA检测的结果比较可靠。在试验感染条件下，通过IFA方法可在感染后5d～9d检测到抗体，抗体在30d～50d出现高峰，随后抗体滴度逐渐下降，在感染后4个～5个月消失。
[0018] 3.2免疫过氧化物酶单层细胞试验
[0019] IPMA具备高特异性和敏感性，其敏感性要比ELISA高。IPMA经常用于感染后7d～15d PRRSV的检测。与IFA一样，IPMA同样在感染后2个～3个月检测比较可靠。这种于1991年建立的PRRSV血清抗体检测法，至今仍是欧美国家广泛使用的血清学诊断方法。IPMA在PRRSV感染后9d～11d可检测到抗体，在35d～50d抗体水平达到高峰，在感染后11个～12个月抗体消失。谭斌等建立一种检测PRRSV血清抗体的IPMA，并组装成PRRSV IPMA抗体检测试剂盒，检测临床中的血清样本，与IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83.3％。[0020] 3.3酶联免疫吸附试验
[0021] ELISA同样也有着很好的特异性和敏感性，对于早期抗体的检测比用IPMA更为敏感。ELISA检测方法有多种形式，即间接ELISA、捕捉ELISA、阻断ELISA、夹心ELISA等。美国IDEXX公司的商品化ELISA试剂盒检测的特异性能达到98％～99％，现在又推出检测性能更好的第2代产品。商品化的试剂盒有高度的一致性，自动化程度高等特点，现已成为国际上血清学检测的主要标准，许多新建血清学检测方法都与此为
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标准检测符合率。有的可以同时检测出美洲型和欧洲型，而且快速简便。[0022] 3.4病毒中和试验
[0023] SVN也具有高度特异性，但其敏感性不如ELISA。其低的敏感性主要由于中和抗体要在敏感后1个～2个月后才能产生。SVN只能说是一种较好的研究方法，它非常费时费力，不适用于日常的PRRSV的诊断，但在所有血清学检测方法中，此法是评价猪群的免疫保护水平的惟一客观可信的方法。有研究表明，当猪群中中和抗体的平均水平大于1∶24才能免受PRRSV的攻击，否则将促进病毒在猪群中的增殖和扩散。[0024] 3.5乳胶凝集试验
[0025] 王忠田等利用纯化的PRRSV重组M蛋白致毒乳胶制成乳胶抗原，成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测，具有良好的特异性。用LAT与IDEXX公司抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测，结果表明LAT的特异性和敏感性均为95％，与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87％，检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点，故是一种适合基层兽医单位检测PRRSV血清抗体的新方法。发明内容
本发明的目的主要是采用经济常用的小鼠为实验动物，通过特殊方法建模，并
采用多种检测方法确证疾病模型的制备。[0027] 1实验器材[0028] 1.1主要试剂
[0029] 病毒基因组DNA/RNA提取试剂购自TIANGEN公司，PCR检测试剂购自Takara公司。PRRSV和PCV2抗体快速检测试剂盒，购自深圳绿诗源生物技术有限公司。[0030] 1.2毒株和实验动物
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[0031] PCV2和PRRSV为本实验室保存毒株，TCID50＝10/mL。Marc-145、PK-15细胞，购自于中国兽药监察所。
[0032] 清洁级6周龄昆明小鼠，购自于中国军事医学科学院兽医研究所实验动物中心[SCXK-(军)2007-004]。[0033] 1.3主要实验仪器
[0034] (1)ABI Mx3005p定量PCR仪(2)Bio-rad680酶标仪(3)EG1150组织包埋机(4)莱卡2135切片机
[0035] 2实验设计
[0036] 将昆明小鼠27只随机分为3组：对照组12只，第1d接种细胞培养液，接种途径和接种剂量分别为：腹腔注射0.5mL、肌肉注射0.2mL、背部皮下多点注射0.3mL。一次攻毒组12只，第1d接种PRRSV和PCV2，接种途径和接种剂量同对照组。连续攻毒组3只，第1、7、14、21、28、35d分别接种PRRSV和PCV2，每次接种途径及接种剂量均与对照组相同。攻毒后第7、14、21和28d分别从对照组和一次攻毒组中随机选择3只小鼠采血并处死，连续攻毒组在攻毒后第35d采血处死。[0037] 2.1体重测量
[0038] 实验小鼠分别于第1、7、14、21、28、35d测量体重，采用SPSS 16.0统计软
[0026]
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件，进行方差分析和t检验。[0039] 2.2病理学检测
[0040] 脱颈椎处死小鼠后进行剖检。无菌采集肺、肝、脾、腹股沟淋巴结，用于PCR检测和病理组织学检测。脏器标本用福尔马林溶液固定，HE染色，镜下观察。[0041] 2.3PCR检测
[0042] 首先，分别针对PCV2 ORF2和PRRSV ORF7序列，利用primer5.0软件设计引物(见表1)。然后，从攻毒各时间组冻存组织中提取总RNA和DNA，采用RT-PCR和荧光定量PCR方法进行定性及定量分析。最后，取PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
[0043] 表1 扩增PRRSV、PCV2和看家基因片段的引物和PCR条件
[0044]
2.4抗体检测
[0046] 试验小鼠采用眼球摘除法取血，分离血清检测抗体效价。血清样品按1∶20稀释，按照PRRSV和PCV2抗体快速检测试剂盒中操作进行检测。[0047] 3结果与分析[0048] 3.1体重增长比率
[0049] 各组之间在1，7，14，21，28，35d的体重增长速率差异明显，正常对照组(C组)增长最快，一次攻毒组(A组)次之，连续攻毒组(B组)最低，A组、B组与C组差异显著(P＜0.01)。说明PRRSV和PCV2对小鼠增重存在抑制作用。(表2)[0050] 表2 各组体重变化(x±s，n＝6)
[0045] [0051]
注：与正常对照组比较，*P＜0.01。
[0053] 3.2病理学观察
[0054] 连续攻毒组能够观察到可见的临床症状和病理变化，主要表现为消瘦、淋巴结肿大，其他组实验小鼠没有产生肉眼可见的临床症状和病理变化。肺脏：攻毒7d后，有浆液性渗出，浅色染色。攻毒14d、21d后，肺泡里有红细胞、巨噬细胞渗出，胞浆淡红色。攻毒28d、35d后，肺泡中红细胞、巨噬细胞，浆液性渗出更明显。腹股沟淋巴结：攻毒7d、14d后，淋巴细胞坏死增多。攻毒21d、28d、35d后，淋巴细胞数减少，细胞内出现空泡，浆液。肝脏：攻毒7d、14d后，肝脏表面有局灶性坏死。21d、28d、35d肝细胞中有空泡，脂肪变性，核溶解，部分肝细胞坏死(只有胞质，无核)，肝动脉有淤血。脾脏：攻毒7d、14d后，在白髓中出现淋巴细胞的坏死。攻毒21d、28d、35d后，白髓区淋巴细胞坏死较多，被膜分散性出血。(见附图1-4)
[0052]
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3.3PCR检测
[0056] 对照组小鼠体内未检出PRRSV和PCV2。一次攻毒组小鼠在肝、脾、肺、淋巴结中发现了病毒复制并呈现一定的规律性。病毒进入机体后，首先在肝脏中复制，随后呈现10d的全身病毒血症，7-10d后转归为局部的病灶血症(主要存在于淋巴结)，而淋巴结的病灶血症可以持续至35d以后，全身病毒血症局部器官病灶增重抑制免疫抑制。可见在攻毒后，病毒在上述组织中均有发现，但最后的转归都是淋巴结。连续攻毒组在第35d进行剖杀，剖检发现仅淋巴结内存在病毒复制，此结果进一步证实了一次攻毒组的结论：PRRSV和PCV2共感染的最终结果是病毒在淋巴结的集中复制，从而对整个机体的免疫系统造成严重破坏，使机体更易受其他致病因子的感染。(见附图5、6、7)[0057] 3.4抗体检测
[0058] 所有攻毒小鼠抗体检测均呈阳性(OD值＞0.4)，连续攻毒组抗体水平明显高于一次攻毒组。(见附图8、9)
附图说明
[0059] 图1：本发明的肺脏切片图；图2：本发明的淋巴结切片图；
图3：本发明的肝脏切片图；图4：本发明的脾脏切片图；
[0061] 图5：本发明的PCR鉴定图；图6：本发明的一次攻毒组PRRSV病毒载量；[0062] 图7：本发明的一次攻毒组PCV2病毒载量；图8：本发明的PRRSV抗体OD值；
[0063] 图9：本发明的PCV2抗体OD值。
[0060]
具体实施方式
[0064] 1PCV2、PRRSV的繁殖[0065] (1)PCV2的繁殖
[0066] 当培养瓶中PK15细胞呈40％～50％融合状态时，加入病毒液1mL/瓶，吸附1h，吸弃病毒液，用PBS洗涤2次，加入新的10％的MEM培养基，在37℃5％CO2的培养箱中培养，等细胞长满瓶底时，传代培养，每代细胞收集一瓶，用于检测细胞的增殖情况，做D-氨基葡萄糖处理组作对照。[0067] (2)PRRSV的繁殖
[0068] 当培养瓶中Marc-145细胞呈50％～60％融合状态时，加入病毒液1mL/瓶，吸附1h，吸弃病毒液，用PBS洗涤2次，加入新的10％的MEM培养基，在37℃5％CO2的培养箱中培养，等细胞长满瓶底时收集，-80℃冻存备用。[0069] 2病理切片的制备[0070] (一)切片的制作
[0071] (1)取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2～0.3cm，大小为1.5cmx1.5cmx0.3cm为宜。取好的组织块用10％福尔马林溶液固定24～48h。然后取固定好的组织，在流水下冲洗1h后，进行梯度脱水：
[0072]
50％酒精，1h；70％酒精，1h；80％酒精，1h；90％酒精，30min；无水乙醇
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I，30min；无水乙醇II，20min；二甲苯∶无水乙醇(1∶1)，20min。
[0073] (2)包埋：经梯度乙醇脱水后再依次用二甲苯I，20min；二甲苯II，20min透明，然后顺序放入溶融的石蜡I、石蜡II、石蜡III中浸透每次1h，共3次；再包埋。[0074] (3)切片：包埋好的石蜡块即可进行切片；切片的厚度为5μm左右。[0075] (二)苏木精-伊红(hematoxylin andeosin，HE)染色方法：
(1)脱蜡。主要用二甲苯脱蜡。依次用二甲苯I，10min；二甲苯II，5min；二
甲苯∶无水乙醇(1∶1)，5min。
[0077] (2)梯度乙醇水化。无水乙醇I，5min；无水乙醇II，4min；95％酒精，4min；90％酒精，4min；80％酒精，4min；70％酒精，4min；50％酒精，4min。
[0078] (3)苏木精染色。水化后的切片放入苏木精染液中浸1min，染细胞核。自来水冲洗1min。
[0079] (4)1％盐酸乙醇分化30s。自来水冲洗1h。
[0080] (6)伊红染色。充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质1min左右。[0081] (7)梯度乙醇脱水。70％酒精，2min；80％酒精，2min；90％酒精，2min；无水乙醇I，2min；无水乙醇II，2mm；二甲苯∶无水乙醇(1∶1)，2min。[0082] (8)二甲苯透明。二甲苯I，5min；二甲苯II，5min。[0083] (9)中性树胶封片。[0084] 3组织总RNA的提取
[0085] 将冻存组织从液氮罐中取出，在已经180℃处理过的研钵中，加液氮研磨至粉末状，加入TRIzol Reagent50-100mg/ml组织，继续研磨成匀浆，再转移到组织研磨器中研磨，充分混匀后，室温5min；加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温5min，4℃12000r/min离心15min，吸取上层水相；加入等体积异丙醇，-20℃静置1.5h，4℃12000r/min离心10min；小心倾弃上清，加入75％乙醇1mL，4℃7500r/min离心5min漂洗后，弃上清，室温风干15min，用40μLDEPC水溶解备用。最后，进行RNA纯度与浓度检测，提取的样品OD260/OD280吸光度比值均在1.8～2.0之间，表明RNA纯度较高，蛋白质及酚去除比较干净，浓度在0.5-1.2μg/μl之间。
[0086] 4总RNA反转录(reverse transcription，RT)反应
[0087] 参照AMV禽源反转录酶使用说明书，cDNA合成方法具体为：取适量总RNA，加入Oligo(dT)18，70℃作用5min后，冰浴5min，补加5×反转录缓冲液、反转录酶、RNasin和dNTPs至20μL，室温反转录5min后，50℃1h，72℃10min。具体反应体系
[0076]
如下：
[0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095]
反转录反应总体系为20μL：5×RT buffer 4μL10mmol/L dNTPs 4μL0.33μg/μL Oligo(dT)18 1μLAMV反转录酶(10U/μL) 1μLRNasin(30U/μL) 1μL总RNA 9μL5组织总DNA的提取
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将冻存组织从液氮罐中取出，在已经180℃处理过的研钵中，加液氮研磨至粉末
状，加入等体积的组织裂解液及10μL的蛋白酶K(10mg/mL)，50℃消化2h，4℃12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡，12000r/min离心10min；上层水相加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀后，12000r/min离心10min；取上层水相加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠，在-20℃放置1h～2h，12000r/min 4℃离心15min；小心倾弃上清，沉淀用70％乙醇1mL于4℃8500r/min离心5min漂洗后，倾弃上清，室温风干15min，用40μL含RNaseA(终浓度为20μg/mL)的TE缓冲液溶解备用。
[0097] 6PCV2、PRRSV和β-actin基因片段的扩增[0098] PCR的反应体系如下：[0099] 2×PCRmix 25μL
[0100] 25pmol/μL上、下游引物各 0.5μL[0101] cDNA/DNA 3.75μL[0102] 加三蒸水至 50μL[0103] 反应程序如下：
94℃5min(预变性)；
[0105] 94℃30s，55℃-56℃30s，72℃30s，共35个循环；[0106] 72℃10min(延伸)。
[0107] 反应结束后，取2.5μL扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳验证产物是否与预期大小相符。
[0108] 7PRRSV、PCV2荧光定量PCR标准曲线的建立与病毒载量的确定[0109] (1)目的因子质粒的提取
[0110] 纯化PCR产物并从凝胶中切下来，用TIANGEN公司胶回收试剂盒回收产物，1μL产物与1μL T3载体轻轻混合，室温反应5min，反应结束立刻将离心管置于冰上。取-80℃冻存的感受态细胞置冰浴中融化后，吸取连接物加入到50μL的感受态细胞中；轻弹离心管壁混匀，冰浴25min；42℃水浴中热激30s，快速将离心管转移至冰浴中2min；加入250μL LB液体培养基(Amp-)37℃150r/min振荡培养60min；吸取200μL菌液涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG平板上，待表面吸干后，37℃倒置平板培养过夜(12～16h)，观察菌落生长情况，根据蓝白斑筛选重组转化体。最后，取1ml菌液送上海生工进行测序，取5ml菌液用TIANGEN公司质粒小提试剂盒提取菌液质粒。提取后的质粒进行浓度与纯度鉴定，OD260/OD280吸光度比值均在1.8～2.0之间，表明质粒纯度较高，蛋白质及酚去除比较干净，浓度在2-4μg/ml之间。并根据浓度值，计算质粒拷贝数。拷贝数/ul＝6.02*1023(copies/mol)/MW(g/mol)*质粒浓度(g/ul)。
[0111] (2)目的因子质粒模板10倍梯度稀释，和各时间点样品模板，分别进行荧光定量PCR，体系如下：
[0112] 2*qPCR Mix 10ul
[0104]
Primerl(5uM) 1ul
[0114] Primer2(5uM) 1ul[0115] Template ＜0.2ug
[0113]
10
CN 101690736 A[0116]
说 明 书
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Rox 0.2ul
[0117] ddH2O 补至20ul[0118] 反应程序如下：[0119] 94℃5min；
[0120] 94℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环；[0121] 融解曲线分析如下：
[0122] 65℃-95℃，每0.2℃读板1次，1s/次。
[0123] 反应结束后，取2μL扩增产物与0.5μL 6*Louding Buffer混匀后，以1.5％琼脂糖凝胶电泳验证产物是否与预期大小相符。[0124] (3)分析结果
[0125] 根据荧光定量PCR仪输出的标准曲线公式，由样品的CT值，计算样品中的病毒拷贝数(即病毒载量)。
[0126] 8PRRSV和PCV2抗体检测步骤：
[0127] (1)取预包被的微孔板，用样品稀释液将待检样品40倍稀释后加入板空中，每孔加100μL。并且3倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设2孔，每孔100μL。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μL稀释液。轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟。
(2)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，300μL/孔，每次静置3分钟倒掉，
最后一次在不掉屑干净吸水纸上拍干。
[0129] (3)每孔加酶标二抗(抗小鼠IgG-HRP结合物)100μL，置37℃温育60分钟(PCV2检测是30分钟)。
[0130] (4)洗涤3次，方法同2。
[0131] (5)每孔加底物A、B液各1滴(50μL)，混匀，室温避光显色10分钟。[0132] (6)每孔加终止液1滴(50μL)，10分钟内测定结果。[0133] PRRSV检测结果判定标准：
[0134] 以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.6，阴性对照孔平均OD630值必须小于0.1。样品OD630值大于0.32，判为阳性；样品OD630值小于0.32，判为阴性。[0135] PCV2检测结果判定标准：
[0136] 1.肉眼判定：“++++”深蓝色，液体不透光；“+++”蓝色，液体微透光；“++”中度蓝色，液体透光；“+”浅蓝色，液体透明；“-”无色，液体完全透明。以显色“++”以上判为阳性。
[0137] 2.酶标仪判定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.6，阴性对照孔平均OD630值必须小于0.2。样品OD630值大于0.42，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.42之间，判为可疑：样品OD630值小于0.38，判为阴性。
[0128]
引物序列表
[0139] <110>北京农学院
[0140] <120>PRRSV和PCV2共感染小鼠疾病模型
[0138]
11
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[0143] <170>PatentIn Version 3.3[0144] <210>1[0145] <211>20[0146] <212>DNA
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