端粒酶活性与良,恶性骨肿瘤细胞分化程度的相关性研究

华中科技大学学报(医学版)

JHuazhongUnivSciTech[HealthSci]Vol.32　No.1　P.68

Feb.2003

端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤细胞

分化程度的相关性研究

陈继革1　　宋先舟1　　陈　玲2

12

　华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科,武汉　430030　武汉市第十医院药剂科,武汉　430033

　　摘要　目的　探讨端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤生长发育的关系,为临床早期诊断骨肉瘤提供理论依据。方法　采用银染法检测了56例良性骨肿瘤、90例骨肉瘤及其瘤旁组织细胞中的端粒酶(Telomerase,TLMA)活性,探讨良、恶性骨肿瘤细胞端粒酶活性表达的差异以及端粒酶活性与骨肉瘤细胞分化程度的关系。结果　骨肉瘤端粒酶的阳性率显著高于良性骨肿瘤,两者的瘤旁组织中皆无端粒酶活性表达;处于分化程度较差的骨肉瘤其端粒酶活性显著高于分化程度较高的骨肉瘤。结论　检测骨肿块细胞中端粒酶的活性有助于良、恶性骨肿瘤的早期鉴别诊断,亦有助于了解骨肉瘤的恶性程度,为早期临床诊治提供重要的理论依据。

关键词　端粒酶;　骨肿瘤;　骨肉瘤;　分化中图法分类号　R73811

RelationshipbetweenTelomeraseActivitywithBenign,MalignantBone

NeoplasmaandDifferentiationofOsteosarcoma

112

ChenJige,SongXianzhou,ChenLingetal

1

　DepartmentofTraumatology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniveristy　　ofScienceandTechnology,Wuhan4300302

　DepartmentofPharmacy,Wuhan10thHospital,Wuhan430033

Abstract　Objective　Toexploretherelationshipbetweentelomeraseactivityandthedevelopmentofbenign,malignantboneneoplasmatoprovidetheoreticalgroundworkforearlydiagnosisofosteosarcoma.Methods　Telomeraseactivitiesin56benignboneneoplasmasand90osteosarcomasandtheiradjacentnon2tumortissuesweredetectedbyTRAP.Thedifferencesoftelomeraseexpressioninbenignandmalig2nantbonetumors,andthecorrelationbetweentelomeraseactivityandthedifferentiationofosteosarcomawasinvestigated.Results　Positiverateoftelomeraseinmalignantbonetumorwassignificantlyhigherthaninbenignbonetumor,whatsoeverbenignbonetumorormalignantbonetumorthetelomeraseactivityofadjacentnon2tumortissueswasnegative.Positiverateoftelomeraseintheosteosarcomaofhighdiffer2entiationwassignificantlyhigherthanthatinlowdifferetiationosteosarcoma.Conclusion　Detectionoftelomeraseinbonetumorswashelpfultotheearlydiagnosisofbenignandmalignantboneneoplasmas,andunderstandingmalignancyofosteosarcoma.

Keywords　telomerase;　bonetumor;　osteosarcoma;　differentiation　　端粒(Telomere)为真核生物染色体末端的串大多数肿瘤细胞中的端粒酶被激活,因而有高水平

联重复结构,其功能是维护染色体的稳定,保持DNA的完整复制。端粒随着细胞的分裂而逐渐缩短,正常细胞终因染色体失去端粒的保护而面临着衰老与死亡。端粒酶(Telomerase)能以自身所携带的RNA模板合成端粒片段并将其加到染色体末端。正常人体细胞(除精源细胞和少数造血干细胞以外)其端粒酶均为失活状态,然而永生化细胞和

陈继革,男,1970年生,主治医师

的端粒酶活性表达[1,2]。本实验将探讨端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤生长发育的关系,为临床早期诊断骨肉瘤提供理论依据。1　材料与方法

111　临床资料

1996年～2002年期间,共收集同济医院及武汉

市第十医院146例骨肿瘤患者,年龄10岁～65岁,平均(20134±8139)岁。良性骨肿瘤56例,包括

© 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.

陈继革等.端粒酶活性与良、恶性骨肿瘤细胞分化程度的相关性研究

・69・

骨瘤12例,骨样骨瘤44例。骨肉瘤90例,其中9例属低恶髓内型,11例属皮质旁型,24例属继发型,46例属高恶髓内型。以上所有病理学诊断皆经本院病理科证实。

112　组织标本的采集与保存

20min,取上清,置新的EP管中-80℃冻存备用。11314　TRAP反应:①反应体系,本实验总反应体

手术标本离体后,立即切取肿瘤组织和相应的瘤旁组织各500mg左右,剪除脂肪组织,在预冷的1×PBS中充分洗去血液,于015h内置液氮中冻存备用。

113　银染法检测端粒酶

积设计为50Λl,含10×TRAP反应液5Λl,1mmol󰃗LdNTP(BoehringerManneim,German)各215Λl,TS100ng,2mg󰃗ml牛血清白蛋白(BSA,Promega,USA)215Λl,TaqDNA聚合酶1U(BoehringerManneim,German),细胞核提取物5Λl,补加H2O至48Λl,室温孵育30min,加CX100ng,用液体石蜡封顶后,置90℃反应2min,灭RNAase。②PCR循环,将反应物置PCR扩增仪中(PEPCR480,USA),循环时间和周期设计为:94℃30s,50℃30s,72℃30s,35个循环,最后72℃延伸2min,产物置-80℃冻存备用。

11315　电泳及银染:取PCR产物10Λl,用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),100V电泳约3h或溴酚蓝接近底部,电泳结束后仔细取下凝胶

银染法是Kim1994年发明的一种很灵敏的检测端粒酶活性的方法[3],我们采用的方法是从Kim的银染法略加改进而来,继承了其灵敏性,却没有放射性污染。检测端粒酶必须避开RNA酶(RNAase),所以本实验中所有玻璃和金属器皿必须

以180℃烘烤8h以上;TIP头、EP管等塑料制品必须以焦磷酸二乙酯(DEPC)浸泡12h后再高压灭菌消毒,实验中所用到的双蒸水(dH2O)仍须去RNAase处理,即将DEPC加入双蒸水中,配成1‰浓度的DEPC溶液作用12h后再经高压灭菌消毒,即为去RNAase水,只有这样的去RNAase水才能用于本实验中各种试剂的配置,本实验的所有操作必须戴手套完成。

11311　主要试剂:①洗涤缓冲液(WashBuffer),1

222乙磺酸(HEPES);mmol󰃗LN222羟基乙哌嗪2N’1mmol󰃗LMgCl2;1mmol󰃗LKCl;1mmol󰃗L二硫

苏糖醇(DTT);1mmol󰃗L二乙醇双(22氨基乙

置10%ethanol中固定5min,1%HNO3脱色3

min,双蒸水漂洗2次,12mmol󰃗LAgNO3染色30min,双蒸水漂洗2次,0128mmol󰃗LNa2CO3及01019%Formalin显色至全部条带显影,10%CH3COOH固定5min。端粒酶阳性病例可见间隔6bp

的梯状电泳条带。

114　统计学处理

端粒酶的阳性率皆以百分率表示(%),统计学分析采用ς2检验。2　结果

211　良、恶性骨肿瘤及其瘤旁组织端粒酶活性表达水平的

醚)四乙酸(EGTA)。②裂解缓冲液(LysisBuffer),10mmol󰃗LTris2HCl,pH715;1mmol󰃗LEGTA;015%32[(32胆酰胺丙基)2二乙铵]2丙磺酸(CHAPS);011mmol󰃗L苯甲基磺酰氟(PMSF);5

2巯基乙醇(Β2mmol󰃗LΒmercaptoehanol);10%甘

比较

　　良性骨肿瘤56例中端粒酶阳性表达者为16例,其阳性率为28157%,骨肉瘤90例中端粒酶阳

性表达者为80例,其阳性率为88189%,将良性骨肿瘤及骨肉瘤的端粒酶阳性率行统计学分析,其差异具有极显著性意义(P<0101)。无论是良性骨肿瘤还是骨肉瘤,它们的瘤旁组织中皆无端粒酶活性表达,其阳性率皆为0%。

212　端粒酶活性表达水平与骨肉瘤细胞分化程度的相关性

油。③引物:TS:5′2;AATCTCGAGCAGAGTT23′

2(CCCTTA)3CCCTTA23′(由上海SangonCX:5′

公司合成)。

11312　10×TRAP反应液:20mmol󰃗LTris2HCl,pH813;115mmol󰃗LMgCl2;63mmol󰃗LKCl;01005%吐温20(Tween20);1mmol󰃗LEGTA;015mmol󰃗LT4g32protein(BoehringerMannheim,German)。

11313　提取细胞核物质:参照Kim的方法略加改

为了研究端粒酶活性的变化与骨肉瘤细胞分化

程度之间的关系,依据1993年WHO骨肿瘤分类标准将骨肉瘤分为高恶髓内型(成骨细胞型、成软骨细胞型、成纤维型、血管扩张型、小细胞型等)、低恶髓内型、皮质旁型及继发型,这几种病理类型的恶性程度是不同的。本组骨肉瘤中,低恶髓内型组9例中端粒酶阳性表达者为5例,其阳性率为5516%;皮质旁型组11例中端粒酶阳性表达者为8

进,取60mg冻存组织于400Λl预冷的洗涤缓冲液中用眼科剪剪碎,4℃离心2min,弃上清,加200Λl预冷的裂解缓冲液,充分混匀后吸入组织匀浆器中,置冰上充分匀浆,冰上孵育30min,4℃离心

© 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.

・70・

华中科技大学学报(医学版)　　2003年2月第32卷第1期

例,其阳性率为7217%;继发型组24例中端粒酶阳性表达者为21例,其阳性率为8715%;高恶髓内型组46例中端粒酶阳性表达者为42例,其阳性率为9117%,可见端粒酶活性是随着骨肉瘤病理分型的恶化而逐渐增加的,其中皮质旁型、继发型和高恶髓内型端粒酶阳性率显著高于低恶髓内型(均为P<0105),而前者之间端粒酶活性的差异却无显著性(P>0105)。3　讨论

粒片段已缩短到极限,大多数细胞凋亡。这就是说,缺乏端粒酶活性的正常细胞和良性肿瘤细胞随着细胞的不断分裂,端粒不断丢失,最终致细胞衰亡,表现为生长的自限性;只有少数细胞,如骨恶性肿瘤细胞,因种种原因将端粒酶激活,而变成了永生化细胞[5～8]。

本实验中,骨肉瘤中端粒酶的阳性率为88189%,良性骨肿瘤中含活化状态端粒酶的阳性率仅为28157%,而所有骨肉瘤和良性骨肿瘤的瘤旁组织中无端粒酶活性表达,说明骨肉瘤细胞中有高水平的端粒酶活性表达,这对于良、恶性骨肿瘤的早期鉴别诊断有很重要的意义,同时也意味着,端粒酶的发现对于骨恶性肿瘤的分子生物学及临床研究无疑是一个新的突破性进展。

随着本实验的深入研究,必然涉及到端粒酶的活性表达与骨肉瘤分化程度的相关性。从本组研究结果表明:处于分化程度较差的骨肉瘤其端粒酶活性表达显著高于分化程度较高的骨肉瘤,但分化程度较差的各组骨肉瘤之间的差异却不具显著性,提示了端粒酶活性随着骨肉瘤病理分型的恶化而逐渐增高,这与临床上的这样一个事实相符即Sangiorgi等曾报道晚期骨肉瘤端粒酶水平有较高的趋向,且低水平端粒酶活性的骨肉瘤预后较好[9]。至于骨肉瘤端粒酶表达的水平与其病理分型的相关性,我们认为有待进一步寻找新的量化指标作定量分析才能最终找到理想答案。

上述基础研究提示了端粒酶有可能成为抗肿瘤治疗的新靶子,如Chen等认为3′叠氮胸甙三磷酸盐(AZTTP)可抑制端粒酶活性[10],也有学者研究利用端粒模板区的反义核苷酸抑制酶和突变端粒成分,改变酶的活性,抑制端粒酶的表达。此外,针对端粒RNA成分也可以寻求新的肿瘤治疗途径。

综上所述,我们认为,端粒酶的活性表达是恶性肿瘤的重要标志,端粒酶活性表达与骨肉瘤的分化程度密切相关。如果对可疑的骨肿瘤行端粒酶活性检测,有助于精确地区分良、恶性骨肿瘤,了解骨肿瘤的恶性程度,为制定临床治疗方案提供重要的理论依据。

参　考　文　献

1　SkulachevVP,AttiJ.Agingisaspecificbiological

functionratherthantheresultofdisorderincomplexlivingsystemsbiochemicalevidenceinsupportofWeis2.Biochemistry,1997,62:1191mann’shypothesis

端粒是人类染色体末端的串联重复结构,其功

能是保护染色体、防止DNA降解、染色体末端融合、染色体缺失和非正常重组,以及解决DNA在细胞分裂时的“末端复制问题”。

端粒酶是Shampy研究四膜虫时发现的一种可延长端粒的核糖核蛋白酶,能以自身所携带的RNA为模板合成端粒片段,并将其加到染色体末端,使端粒片段的长度保持恒定[4]。许多肿瘤细胞都是依靠端粒酶的激活来达到永生化的目的,从而能够进行无限增殖。

目前,端粒酶与细胞永生化的关系已为大多数学者接受,基于此,在对于骨恶性肿瘤的生物学理解中,我们大胆推断端粒酶的活性表达是骨恶性肿瘤的重要标志,是骨肿瘤细胞获得永生化的必经途径,而这种永生化被认为是恶性肿瘤发生、发展的重要一步。并通过本实验发现:端粒酶的活性在骨恶性肿瘤(骨肉瘤)可被激活,其功能主要是与骨恶性肿瘤(骨肉瘤)的永生化进而获得无限增殖的能力相关。我们认为其在骨恶性肿瘤中的激活机制可能如下所述。

端粒酶活性可在人类胚胎细胞中表达,以保持端粒长度的稳定,但随着细胞的发育,端粒酶活性受到抑制,人类在出生以后除精源细胞及一些造血干细胞以外,正常人体细胞都没有端粒酶活性的表达,故端粒会随着细胞的分裂而逐渐缩短。当端粒片段缩短到只剩下几千个碱基对时,由于DNA缺乏保护,细胞周期检查点发送细胞周期停止的信号——M1信号,使得DNA合成停止,从而细胞进入第一个死亡阶段——M1期,细胞开始衰老。但此时的细胞并未死亡,只是停止在细胞周期的G1期,在某种情况下可再次进入细胞周期的循环,当然大部分细胞无法逃避此期而最终死亡,只有极少数细胞由于病毒基因整合或P53、Rb等抑癌基因突变和缺失而逃避此期并继续分裂,但都将进入细胞的第二个死亡阶段——M2期,又称“危机期”,此时细胞的端

(下转第80页)

© 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.

・80・

华中科技大学学报(医学版)　　2003年2月第32卷第1期

抑制蛋白(apoptosisinhibitorprotein,AIP󰃗in2

[8]

hibitorapoptosisprotein,IAP)家族成员的作用。在人类T细胞及Jurkat细胞系中,c2IAP2的过量表达可拮抗TNF诱导的细胞凋亡;此外,X染色体连锁AIP家族成员(XIAP)可抑制许多药物诱导的细胞凋亡。在NF2ϑB缺陷型细胞中,TNF受体偶联蛋白1和2(TNF2receptorassociatedprotein1and2,TRAP1和TRAP2)、IAP1、IAP2必须都表达才能使细胞躲避TNF诱导的细胞凋亡,这些蛋白质均是NF2ϑB的下游靶基因产物,它们能有效阻断半胱天冬酶(Cysteine2containingasparase2specificprotease,Caspase)的活化,从而抑制TNF诱导的凋亡[9]。

313　NF-ϑB的应用前景

Chem,1997,272:12952

2　BegAA,BaltimoreD.AnessentialroleforNF2ϑBin

2inducedcelldeath.Science,1996,preventingTNF2Α

274:782

3　vanAntwerpDJ,MartinSJ,KafriTetal.Suppres2

2inducedapoptosisbyNF2ϑsionofTNF2ΑB.Science,

1996,274:787

4　WangCY,MayoMW,BaldwinAS.TNFandcancer

therapy2inducedapoptosis:potentiationbyinhibitionofNF2ϑB.Science,1996,274:784

5　J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著.金

冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1996.16～65

6　WangCY,JamesCCJr,LiuRetal.Controlofin2

duciblechemoresistance:enhancedanti2tumortherapythroughincreasedapoptosisbyinhibitionofNF2ϑB.NatMed,1999,5:412

7　JeremiasI,KuppatC,BaumannBetal.Inhibitionof

nuclearfactor2ϑBactivationattenuatesapoptosisre2.Blood,1998,91:4624sistenceinlymphoidcells

8　ChuZL,MckinseyTA,LiuIetal.Surpressionoftu2

mornecrosisfactorinducedcelldeathbyinhibitorof.ProcA2apoptosisc2IAP2isunderNF2kappaBcontrolcadSciUSA,1997,94:10057

9　WangCY,MayoMW,KomelukRGetal.NF2ϑBan2

tiapoptosis:

inductionofTRAF1andTRAF2and

cIAP1andcIAP2tosuppresscaspase28activation.Sci2ence,1998,281:1680

(2001208229　收稿)

由于抑制NF2ϑB的活化,能明显增加化疗药物及TNF对某些细胞的凋亡诱导效应,目前,人们正

试图从NF2ϑB激活通路上的多个环节阻断其激活过程,以期达到阻断其调控抗凋亡基因蛋白合成的目的。因此,在临床工作中可检测化疗不敏感肿瘤细胞的NF2ϑB活性,若NF2ϑB活化在细胞逃避凋亡及获得耐受中起了重要的作用,则可选用NF2ϑB抑制剂作为这些肿瘤治疗的主要辅助工具,从而为临床肿瘤的治疗提供了新思路。

参　考　文　献

1　BolandMP,FosterSJ,OneillLAetal.Daunorubicin

activateNF2ϑBandinducesϑB2dependentgeneinHL260promyelocyticandJurkatlymphomacells.JBiol

　　(上接第70页)

2　TriebK,ThurnherD.Reversibledownregulationof

telomeraseactivitybyhyperthermiainosteosarcoma.IntJHyperthermia,2000,16:445cells

3　KimNW,PiatyszekMA.Specificassociationofhuman

telomeraseactivitywithimmortalcellsandcancer.Sci2ence,1994,266:2011

4　ShampayJ,BlackburnEH.Tetrahymenamicronuclear

sequencesthatfunctionastelomeresinyeast.NuclAcidsRes,1988,17:3247

5　WrightWE,PiatyszekMA.Experimentalelongation

oftelomereextentsthelifespanofimmortalnormalcell.EMBOJ,1996,15:1743hybrids

6　HiyamaE,YokoyamaT.Telomeraseactivityingastric

cancer.CancerRes,1995,55:3258

7　TabaraH,NakanishiT.Telomeraseactivityinhuman

livertissues:comparisonbetweenchronicliverdisease.CancerRes,1995,55:andhepatocellullarcarcinomas2734

8　CounterCM,CuptaJ.Telomeraseactivityinnormal

.Blood,leukocytesandinhematologicmalignancies1995,85:2315

9　SangiorgiL,GobbiGA.Presenceoftelomeraseactivity

indifferentmusculoskeletaltumorhistotypesandcor2.IntJCancer,2001,95:relationwithaggressiveness156

10　ChenSF,MaineIP.

2azidothymidineEffectof3′

2azothymidine(AZT)ontriphosphate(AZTTP)and3′

telomeraseandtelomerefunction.ProcAmerAssocCancerRes,1995,36:554

(2002201215　收稿)

© 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.