冬虫夏草发酵液和菌丝体中主要核苷类成分分析

杨吉祥;曹照平;周广麒;李航

【摘 要】为研究冬虫夏草发酵液和菌丝体中核苷类物质的种类和含量,将冬虫夏草进行液体发酵培养,再经超声提取、醇沉、真空浓缩等方法获得供试样品Ⅰ(发酵液醇提成分)和供试样品Ⅱ(菌丝体提取物醇提成分),应用高效液相色谱法对供试样品中主要核苷类物质进行测定,结合次黄嘌呤、腺嘌呤、腺苷、虫草素等标准品图谱和标准曲线方程对其进行定性定量分析.结果显示,试验条件下,发酵液中含有较多的虫草素和次黄嘌呤,产率分别为28.470、23.436 mg/L;菌丝体中含有较多的腺苷,产率为5.067 9 mg/g.

【期刊名称】《大连工业大学学报》 【年(卷),期】2015(034)004 【总页数】3页(P243-245)

【关键词】冬虫夏草;发酵液;菌丝体;核苷类物质;高效液相色谱 【作 者】杨吉祥;曹照平;周广麒;李航

【作者单位】大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034 【正文语种】中 文

【中图分类】TS218;Q939.97

0 引言

虫草中的核苷类物质具有显著的药理作用

［1］，是冬虫夏草研究的焦点之一。虫草中核苷类物质的测定方法主要有HPLC法

［2］、HPLCESI－MS法 ［3］、TLC法 ［4］、毛细管电泳分析

［5］等，其中HPLC法以其简便、准确、稳定、样品消耗少等诸多优点，应用较为普遍。本研究采用HPLC法对冬虫夏草发酵液和菌丝体中的次黄嘌呤、腺嘌呤、腺苷和虫草素等进行定性定量分析，并比较二者组成和含量的差异。 1 材料与方法 1．1 菌 种

Cordyceps sinensis FFCC5231，大连工业大学食品发酵微生物菌培养与保藏中心（CFFMCC），试管斜面26℃活化培养3～5d。 1．2 试 剂

Hypoxanthine，Adenine，Adenosine，Cordycepin，超纯水别配制成100．00mg／L的标准储备液，再根据检测要求用超纯水稀释成相应质量浓度的工作液，4℃保存。甲醇，色谱纯，Sigma公司。 1．3 方 法

1．3．1 供试样品的制备 活化菌株接种于液体培养基

［6］，26℃培养5～7d，摇床转速160r／min。所得发酵物经4 000r／min离心15min得发酵液和菌丝体，菌丝体再经超纯水洗涤3次，冻干，

备用。

100mL发酵液→浓缩→加3倍体积95%乙醇，4℃沉淀10h→11 000r／min离心10min，取清液→蒸干→超纯水定容至25mL→0．22μm微孔滤膜过滤→供试样品Ⅰ。

0．5g菌粉→超声破碎：200 W，10min（启动1s暂停3s）→超声提取：100W，60℃，40min→11 000r／min离心10min，取清液→沉淀物反复提取2次，合并清液→同发酵液处理→超纯水定容至10mL→0．22μm微孔滤膜过滤→供试样品Ⅱ。

1．3．2 色谱条件 色谱柱：反相C

18高效液相色谱柱（Unitary，250mm×4．6mm，5μm）；流动相：A：20mmol／L NaH 2PO 4、Na 2HPO

4，pH 6．89；B：色谱纯－甲醇；线性梯度洗脱程序见表1；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：260nm。

表1 流动相洗脱程序

Tab．1 Elution procedure of mobile phase

1．3．3 核苷物质标准曲线的测定

将核苷物质标准品的标准储备液稀释成表2所示质量浓度的工作液，用高效液相色谱进行分析测定，以峰面积（y）对应质量浓度（x）作图。 表2 工作液质量浓度

Tab．2 Working solution concentration

2 结果与讨论

2．1 混标溶液的液相色谱检测结果

将混标溶液进行高效液相色谱分析，结果如图1所示。图1显示4种标准品的峰形和分离度均较好，可对供试样品进行分析测定。

图1 混标溶液图谱

Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution

2．2 标准曲线测定结果

通过高效液相色谱测定各工作液质量浓度下对应各标准品的峰面积，从中选取10个点进行标准曲线分析，结果见表3。根据表3分析各标准品质量浓度与峰面积的线性关系，所得回归方程如表4所示。由表4可见，4种标准品在实验质量浓度

范围内，质量浓度与锋面积呈良好的线性关系，可以对供试样品中相应组分进行外标定量。

表3 不同工作液浓度对应各物质的峰面积

Tab．3 Peak area of each substance corresponding to different working solution concentrations （μV·s －1）

表4 标准品标准线性方程及相关系数

Tab．4 Regression equations and correlations of standards

2．3 供试样品组分分析

供试样品高效液相色谱图见图2、图3。图2中依次出现的主要峰为次黄嘌呤（12．311min）、疑似鸟嘌呤（16．801min）、虫草素（30．086min）；图3依次出现的主要峰为疑似胸腺嘧啶（15．352min）、疑似肌苷（22．664min）和腺苷（28．297min）。

图2 供试样品Ⅰ高效液相色谱分析图谱

Fig．2 HPLC chromatogram of test sampleⅠ

图3 供试样品Ⅱ高效液相色谱分析图谱

Fig．3 HPLC chromatogram of test sampleⅡ

根据测得标准曲线方程对色谱图中分析出的两种供试样品中标准品进行准确定量，并根据虫草素标准曲线方程对疑似物质进行含量估计，可知图2中次黄嘌呤、疑似鸟嘌呤、虫草素质量浓度分别为93．743 3、134．516 9、113．880 5mg／L，图3中疑似胸腺嘧啶、疑似肌苷、腺苷质量浓度分别为411．707 2、374．021 2、506．786 2mg／L。

根据图2、图3中各主要核苷类物质浓度算得各组分在发酵液和菌丝体中的产率，结果见表5。

表5 发酵液和菌丝体中主要核苷类物质产率

Tab．5 Contents of main nucleoside substances in fermentation broth and mycelia

注：“＊”为疑似物质；“—”为不含或含量极少；培养条件：26℃，

7d，转速160r／min；菌丝体对发酵液的得率约为10g／L。 3 讨论

高效液相色谱法对供试样品Ⅰ、Ⅱ的分析结果显示，各主要核苷类物质的峰形和分离度均较好，此方法可应用于虫草中核苷类物质的测定 ［7］。

液体发酵培养的冬虫夏草，其胞内和胞外核苷类组分在种类和含量上均有较大差异，腺苷主要存在于胞内，并且含量较高，可能主要在胞内代谢产生并作为合成虫草素的前体物质在胞内被转化

［8］；虫草素和次黄嘌呤则主要存在于胞外并且含量较高，与刘艳芳等

［9］的研究不谋而合，应为胞内合成再排放于胞外的代谢产物，并且次黄嘌呤不参与虫草素的合成

［10］。此结果可为冬虫夏草的开发与利用提供参考，为冬虫夏草中核苷类物质的代谢方式和路径研究提供基础理论资料。在冬虫夏草培养过程的不同时期，核苷类物质种类和含量的差异有待进一步研究论证。 【相关文献】

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