脂肪酶拆分外消旋_苯乙胺的研究进展

中国酿造

2010年第5期总第218期·23·

脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺的研究进展

吴华昌，由耀辉，邓

静，马钦远

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡3000）

摘要：利用脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺是目前生产光学纯α-苯乙胺的重要方法之一，文中主要从脂肪酶拆分机理、脂肪酶的选择、

酰化剂的选择及反应体系溶剂的确定等方面，阐述近年来国内外研究状况。关键词：脂肪酶；光学纯；酰化剂；溶剂Q556中图分类号：

文献标识码：A

文章编号：02-5071（2010）05-0023-03

Chiralresolutionofracemicα-phenylethylaminebylipaseWUHuachang,YOUYaohui,DENGJing,MAQinyuan

(DepartmentofBioengineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong3000,China)Abstract:Chiralresolutionbylipaseisanimportantwayforproductionofopticallypureα-Phenylethylamine.Mechanismofchiralresolutionbylipase,choiceoflipasesandacylationagents,andselectionofreactionsolventwasreviewedinthepaper.Keywords:lipase;opticalpurity;acylationagent;solvent

手性是自然界化合物的普遍特征。构成自然界物质的一些手性分子虽然从化学式组成来看是一模一样，但其空间结构完全不同，其性质也是不同的[1]。如DL-（±）-合霉素的治疗效果仅为D-（-）-氯霉素的一半；20世纪50年代“海豹儿”出生的灾难性事故，正是由于“反应欧洲发生的

停”是一种外消旋的手性药物，其（R）型异构体具有镇静）型却具有致畸作用。因此，如何将物质纯化为作用，而（S光学纯级别是目前化学工业的重要研究目标。α-苯乙胺（DL-α-Phenylethylamine）是一种有着良好应用前景的化工中间体原料，由于α-苯乙胺分子中含有一个手性中心，可分为（R）和（S）2种对映异构体及外消旋α-苯乙胺，其中（R）、（S）这2种单一对映体既可以作为某些外消旋有机酸或醇类物质的手性拆分试剂，又可以作为不对称合成的手性原料，因此是一种重要的手性中间体[2]。目前光学纯级别化合物的获得方法主要有手性合成和外消旋体拆分2种。本文主要阐述利用脂肪酶对外消旋α-苯乙胺的拆分研究进展。1脂肪酶拆分机理

分子模拟研究表明，对映体在CandidaAntarctica脂肪

收稿日期：2009-12-11

酶B活性中心以不同的方式定向[3]。手性底物的对映体以不同方式定向和结合到酶活性中心，这一事实可以作为改变对映体选择性的依据。目前被普遍接受的是“立体特异性口袋”理论：在酶的立体结构中存在着一个氧负离子空“活性口袋”，这个活性口袋是由几个氢键供体构洞，称为成的，主要为酶骨架及其侧链中酰胺的质子。而决定脂肪酶底物选择性的最重要因素正是活性口袋的空间和疏水性质以及四面体中间体的稳定性。JENSENRG等[4]通过研究CandidaAntarctica脂肪酶B与2-己酸辛酯的过度态结构对该脂肪酶的立体选择性进行了分析，从结构来看，酶活性部位是由一个丝氨酸、一个组氨酸和一个天冬氨酸的残基（Ser-His-Asp）组成的“催化三联体”，并且活性“手性”构象，具有高度选择的特征。脂肪酶在催化部位呈

过程中将这种特征传递给手性底物，使反应具有内在的选择性，即优先催化底物中的某些组分，客观上表现为不同竞争性底物反应速度的差异[5]。2脂肪酶的选择

酶法拆分手性物质主要是利用酶的立体选择性，整个反应过程就是外消旋底物的2个对映体竞争酶的活性

作者简介：吴华昌（1970-），男，四川隆昌人，副教授，主要从事非水相酶催化应用研究工作。

αααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααtheformationofflavourcomponentsincider[J].JIBrewing,1988,94andperries[J].JSciFoodAgr,1965,16:384-3.

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ForumandSummary

中心，由于两者反应速率不同而产生选择性，从而使反应产物或剩余底物具有单一光学活性。酶的光学选择性就是通常所说的对映体选择率（enantioselectivity，E）。E值反映的是酶拆分选择性的大小。拆分反应的效果通常用光学纯度（opticalpurity，op）或对映体过量值（enantiomericexcess，e.e）来表示。微生物脂肪酶多数来源于真菌和细菌，现在约有30多种不同来源的商业化脂肪酶，加之科研机构不断发现的新型脂肪酶，对选择一种高效立体选择性的脂肪酶给予较大的空间[6]

。脂肪酶选择性酰化α-苯乙胺

的反应机理：

WENS等[7]考察了lipaseLIP2（YILip2）在45℃时，以乙酸乙酯作为酰化剂，添加3%正己烷及6倍固定化脂肪酶，反应6d，产物e.e值可达到96.0%。

秦韶巍[8]考察了实验室自制的LipaseCAN、LipaseRH2种脂肪酶对α-苯乙胺的拆分效果，并与Novozyme435、Li-paseTL、

LipaseRm、LipaseJan等几种商品酶在35℃，以乙酸乙酯作为酰化剂和溶剂，反应48h进行了对照，结果表明，Novozyme435拆分效果最好，底物转化率达到44.6%，产物的e.e值为58.2%，由于在尚未对反应条件优化的前提下，可以认为Novozyme435是一种较为理想的商品酶。

脂肪酶选择性酰化α-苯乙胺的反应机理：

VARMAR等[9]考察Lipases-L-1（Candidacylindracea-CCL

）、L-4（P.seudomonascepacia）、L-17（CALB），L-20（Alcaligenes）、L-21（Pseudomonasfluroscens）、lipases-Chi-razymesL2（CALB）等几种商品酶在28℃时，以乙酸乙酯作为酰化剂和溶剂时拆分α-苯乙胺效果进行比较，结果见附表。

由附表可知，L2、CALB、PS-C、P.cepacia及PS-D、P.cepacia均有较好的拆分效果，且L2、CALB反应时间24h，产物op值达到99.0%。3酰化剂的选择

酰化剂作为反应过程的一种底物，对脂肪酶拆分催化α-苯乙胺反应有着至关重要的作用，在选择酰化剂的同时，要考虑对酶活、反应的转化率、酶的立体选择性等的影响。酰基链的大小、定位在与酶结合过程中是最重要的过程。通常情况下，脂肪酶活性部位被一个“盖子”包住，在酶界面激活过程中，随着活性部位“盖子”的移动，活性部位就暴露出来，在“盖子”和酶的表面间形成一个疏水沟，沟的大小恰好容纳酰基链，沟的非极性残基和非极性酰

基链间的相互作用而稳定的结合[10]。在不可逆反应中，肟酯可以作为酰基转移试剂，但存在一些缺点：辅底物抑制和反应的可逆性。烯醇酯作为酰基供体，

是不可逆转酯化反应的最佳选择。乙酸乙酯、甲氧基乙酸乙酯、乙氧基乙酸乙酯均是目前研究较多的酰化剂。

附表不同脂肪酶拆分效果对比

Attachedtable.Comparisononenantioselectivityandconversion

rateofdifferentlipases

脂肪酶种类反应时间/h酰胺产量/%

比旋光度光学纯度/%

L-1，CCL96.100.000.00L-17，CALB4834.00+10.437.78L2，CALB2460.00+130.0099.90L10Alcaligenes9627.00+22.4016.72L-21，P.cepcia9627.00+22.4016.72L-4，P.cepacia9634.12-8.406.28PS，P.cepacia4847.15+7.245.40PS，P.cepacia90.00+4.823.59PS-C，P.cepacia9659.42+112.4483.58PS-D，P.cepacia9667.87+67.2750.28PS-D，P.cepacia*

128

13.80

+57.30

42.76

注：“*”表示反应以正己烷作为溶剂，乙酸乙酯为酰化剂

德国BASF公司是世界上最大的手性胺生产公司，采用甲氧基乙酸乙酯作为酰化剂拆分α-苯乙胺，现以1000t/年的规模工业化生产。

VARMAR等[9]将酰化剂由乙酸乙酯变为乙氧基乙酸乙酯，在其他条件不变的前提下（参照附表），脂肪酶PS-C的拆分效果，从83.58%提高至99.9%；脂肪酶PS-D的拆分

效果从50.20%提高至99.9%。

不同基团的酰化剂为何能提高反应效率，目前机理尚未明确。可能由于甲氧基及乙氧基均为供给电子基团，在催化过程中竞争酶的活性中心较为有利，同时，不同脂肪酶可能对酰化剂的链长较为敏感[11]。如Geotrichumcandidum的2种异构酶的选择性差异很大。异构酶B对长碳链不饱和脂肪酸，尤其是对9-位为顺式结构的十八碳不饱和酸具有选择性，而异构酶A的选择性则比较广泛，对中碳链和不饱和的长碳链都有作用[12]。4反应体系溶剂的选择

以前的观点认为，酶只有在水中才有活性，在有机溶剂中会立即失活，直至20世纪70年代末期才证实酶在有机溶剂中确实有活性，俄罗斯莫斯科Lomonosov大学的Klibanov等报道了N-乙酰基-L-色氨酸在氯仿中与乙醇的酯化反应，酯的合成收率达到100%，而在无有机相的水中酯的收率仅为0.01%[13]。LANNEC等[14]提出了利用溶剂的logP值预测酶活性的简单规则，一般酶在logP>4时反应活性较高，在2logP<2时反应活性较低。专论与综述

中国脂肪酶作为典型的非水相酶，不同的溶剂对脂肪酶对映体选择性有着很大的影响。在Pseudomonas脂肪酶（lipaseAH）催化的潜手性双酯水解反应中，用水饱和异丙醚代替水饱和环己烷时，发现脂肪酶对映体选择性发生反转。分子模式研究揭示对映体选择性反转的原因：在不同的溶剂中，对映体与酶活位点结合方式不同，进而表现出不同的对映体选择性[15]；

另一种解释是附着于活性位点的溶剂分子不同程度地干扰了不同对映体的结合[16]。

附表中，VARMAR等[9]将溶剂由乙酸乙酯变为正己烷，产物收率，产物光学纯度均明显下降。同时秦韶巍[8]分别采用正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯和乙酸异丙酯作为有机溶剂，考察LipaseCAN和LipaseRH的酶促反应效果，结果发现在正己烷、石油醚等有机溶剂中反应转化率较低，在乙酸乙酯、乙酸异戊酯中转化率较高。这可能由于以正己烷作为溶剂时，α-苯乙胺并不能与溶剂混溶，从而导致底物与酶的接触机率小，反应难以进行。另外由溶剂本身的性质决定，

针对不同脂肪酶，可能产生毒害及抑制作用。溶剂的粘稠度可能会造成脂肪酶的传质阻力，致使酶无法充分的与底物接触。5α-苯乙胺光学纯度的检测

手性拆分效果的判定通常需要对对映体的光学纯度进行测定。

目前的测定方法主要包括旋光法[17]、双拆分法、同位素稀释法、核磁共振波谱法[18]及色谱法[19]等。针对目前α-苯乙胺光学纯度的测定主要有旋光法、

核磁共振波谱法和色谱法等[20]。其中旋光法测定光学纯度时，如果该物质中含有其他光学杂质，那么得到的旋光值就会发生偏差，进而无法测出样品的真实光学纯度，因而此法误差较大，故不详细介绍。色谱法是目前较为常见也是较为便捷的方法，气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC）应用最广。气相色谱法适用范围仅限于分子量低且热稳定性好的化合物，应用于拆分α-苯乙胺的研究报道较少，多采用液相色谱，主要包括间接法（衍生化HPLC法）和直接法（HPLC手性固定相法）等。

间接法（衍生化HPLC法）是对消旋体α-苯乙胺进行柱前衍生化处理，通过在手性中心引入官能团，产生相应的非对应体衍生物，从而在经过色谱柱时得以分离[21]。徐旭等[20]用4-甲氧基苯甲酸将苯乙胺进行1∶1的衍生化反应，温度控制在30℃，

振荡反应2h。以正己烷、异丙醇或乙醇为流动相，在DNB-pg手性固定相上对对映体衍生物进行拆分，优化分析条件，分离因子可达1.3以上。唐琴[21]

采用酰氯A对

消旋体α-苯乙胺进行柱前衍生化处理，通过在手性中心引入长链酰胺基团，实现其在DNB-pg手性固定相上的直接対映体分离，分离因子达到1.26。

直接法（HPLC手性固定相法）采用手性固定相，手性固定相充当了手性识别的重要功能，因此选择合适的手

酿造

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性固定相尤为重要。目前手性固定相主要分成以下几类：Pirkle型手性固定相、蛋白质手性固定相、环糊精（CD）手性固定相、纤维素多糖衍生物手性固定相等[22-23]。秦韶巍等[8]采用ChiralcelOB-H（手性柱），流动相为V（正己烷）∶V（异丙醇）∶V（二乙胺）=9∶1∶0.01，基本实现了基线分离。6展望

将物质纯化为光学纯级别是当今精细化工及药物化工的发展趋势，生物催化以其高效、环保、清洁等特点在其中扮演着重要的角色，如何找到一条成熟的工艺使之工业化是关键。目前脂肪酶拆分α-苯乙胺工业化的局限性主要有（1）脂肪酶的拆分机理尚未确立：“立体特异性口袋”理论虽被广泛接受，但仍为假设理论，且尚有很多不足[24]。（2）脂肪酶立体选择性较低：发酵生产的天然脂肪酶大多立体选择性较低，需要进行广泛的筛选，挑选合适的脂肪酶类型，同时要对粗酶制剂进行纯化。针对那些立体选择性不理想的可以利用蛋白质工程技术、

基因工程及化学修饰等来改变天然酶的结构或构象。（3）脂肪酶利用率较低，脂肪酶较为昂贵，且作为生物大分子易失活。因此要想大规模工业生产就必须提高脂肪酶的利用率，目前最为有效的办法就是酶的固定化[25-27]。（4）底物及溶剂的选择：底物及溶剂的确定不仅仅取决于反应的转化率、产物的e.e值，更要考虑到底物溶剂的成本及下游的回收、产物提取、酶的利用次数等[28]。（5）反应体系水活度的控制：脂肪酶催化过程需要微量的水，通常用体系的水活度表示[29]。在确定最适水活度的同时，随着反应进行，底物的电离往往会消耗一定量的水，导致体系水活度的改变，因此，如何

维持恒定的水活度也是工业化生产必须要考虑的[30]。参考文献：

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ForumandSummary

5'-磷酸二酯酶的应用与研究进展

邵

2

帅1，田延军2，赵祥颖2，刘建军1，*

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；2.山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南250013)

摘要：5'-磷酸二酯酶是一种能将单链DNA和RNA水解为5′-核苷酸的磷酸二酯酶，是酶法生产5′-核苷酸的主要工业用酶。文中对

5'-磷酸二酯酶的来源、制备方法、应用及研究进展进行了综述。关键词：5'-磷酸二酯酶；5'-核苷酸；脱氧核糖核酸；核糖核酸Q556中图分类号：

文献标识码：A

文章编号：02-5071（2010）05-0026-04

Applicationandresearchprogressof5′-phosphodiesterase2

SHAOShuai1,TIANYanjun2,ZHAOXiangying2,LIUJianjun1，*

(1.SchoolofFoodandBioengineering,ShandongInstituteofLightIndustry,Jinan250353,China;2.TheKeyLaboratoryofFoodandFermentationofShandong,Jinan250013,China)Abstract:5'-Phosphodiesteraseisakindofphosphodiesterase,whichhydrolyzesonlysinglestrandedRNAandDNA,andmainlyusedforproduction

of5'-nucleotide.Source,properties,preparationmethods,applicationandresearchprogressof5'-Phosphodiesterasewerereviewed.Keywords:5'-phosphodiesterase;5'-nucleotide;DNA;RNA

核酸分解的第1步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶（phosphdies-terase）。专一性水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶（nuclease）。早在1940年，人们便从牛胰中分离出一种降解

收稿日期：2009-12-09作者简介：邵

RNA的酶，并将其命名为牛胰核糖核酸酶，简称RNaseI。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分成3'-磷酸二酯酶和5'-磷酸二酯酶。其中，5'-磷酸二酯酶（5'-PDE）是一种能在

帅（1985-），女，江苏常州人，在读硕士研究生，研究方向为微生物资源开发；刘建军*，教授，通讯作者。

′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′2006.宋航，孙娟，等.衍生化HPLC法测定α-苯乙胺的光学[20]徐旭，

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