lncRNA ANRIL在乳腺癌中的作用及机制研究

lncRNA ANRIL在乳腺癌中的作用及机制研究

作者：汤红平 钟琳 姜辉 高慧军 陈莹莹 来源：《中国医药导报》2018年第16期

[摘要] 目的 探讨长链非编码RNA-ANRIL（lncRNA ANRIL）在乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡中的作用及相关机制。 方法 在乳腺癌细胞中瞬时转染ANRIL小干扰RNA片段（si-ANRIL），采用Real-time PCR检测干扰效果，MTT法检测降低ANRIL表达对细胞增殖能力的影响，Transwell实验检测降低ANRIL表达对细胞侵袭能力的影响，流式细胞术（FCM）检测降低ANRIL表达对细胞凋亡能力的影响，Western blot检测降低ANRIL表达对p53蛋白表达的影响；在乳腺癌细胞中瞬时共转si-ANRIL和p53小干扰RNA片段（si-p53），采用MTT、Transwell、FCM等方法检测乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的改变。 结果 干扰ANRIL表达，乳腺癌细胞增殖减慢，侵袭迁移能力减弱，凋亡率显著升高（P < 0.05），p53通路被激活；同时干扰p53可部分逆转ANRIL表达下降所致细胞增殖、侵袭能力下降和凋亡能力增强。 结论 lncRNA ANRIL可通过抑制p53信号通路促进乳腺癌细胞增殖、侵袭，抑制凋亡，进而促进乳腺癌发生发展。

[关键词] 长链非编码RNA-ANRIL；乳腺癌；增殖；侵袭；凋亡

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0017-04 [Abstract] Objective To explore the role and mechanism of long noncoding RNA-ANRIL

（lncRNA ANRIL） in proliferation， invasion and apoptosis of breast cancer cells. Methods Breast cancer cells were transiently transfected with si-ANRIL. Real-time PCR was used to confirm the interfere effect of si-ANRIL， MTT assay was used to detect cell proliferation， transwell method was used to detect cell invasion， flow cytometer （FCM） was used to detect cell apoptosis， Western blot was used to detect the protein expression level of p53. Breast cancer cells were co-transfected with si-ANRIL and si-p53， MTT assay， transwell method and FCM were used to detect cell proliferation， invasion and apoptosis. Results ANRIL knockdown decreased cell proliferation， invasion， and increased cell apoptosis （P < 0.05）. ANRIL knockdown activated p53 signal pathway. Simultaneous p53 knockdown partially reversed the effect of ANRIL knockdown.

Conclusion LncRNA ANRIL can promote the proliferation， invasion and inhibit apoptosis of breast cancer cells by inhibiting p53 pathway， thus promoting the occurrence and development of breast cancer.

[Key words] Long noncoding RNA-ANRIL； Breast cancer； Proliferation； Invasion； Apoptosis

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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。乳腺癌的早期检出率较低，发现时多半已经是中晚期，因此，深入探讨乳腺癌分子生物学特征、阐明乳腺癌的发生机制对提高乳腺癌的早期诊断、改善患者治疗效果具有重要的临床意义。研究发现，长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNA）可作为致癌或抑癌基因参与肿瘤的发生发展，其表达异常与肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡能力密切相关[1]。lncRNA的异常在乳腺癌的发生发展过程中也发挥着重要作用。lncRNA ANRIL基因位于染色体9p21.3区域，全长3.8 kb，在人体内多种正常组织中均有表达。ANRIL在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肝癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等，发挥原癌基因的功能。许多研究发现，lncRNA ANRIL在乳腺癌中表达升高[2-3]，但其在乳腺癌中具体作用及机制尚不清楚。本研究以乳腺癌细胞系MCF7细胞为研究模型，选择lncRNA ANRIL作为研究对象，探讨其在乳腺癌中的具体作用及相关机制，利用RNA干扰技术研究降低ANRIL表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响，为临床乳腺癌早期诊断及治疗研究提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试剂和材料

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7、ZR751和正常乳腺上皮细胞MCF10A（美国ATCC公司），胎牛血清，DMEM、DMEM/F12培养液（美国Gibico公司），si-ANRIL及si-p53（上海捷瑞生物工程有限公司），逆转录试剂盒、SYRB Green染料（大连宝生物工程有限公司），p53抗体（sc47698，美国SantaaCruz公司）、p21抗体（sc71811，美国SantaaCruz公司），MTT溶液（上海翊圣生物科技有限公司），酶标仪（Elx800，美国Biotek公司），凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。 1.2 MTT法检测细胞增殖

收集对数生长期的细胞以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板，贴壁后24 h内完成转染si-ANRIL或si-p53，每24小时检测1次增殖情况，连续检测至96 h。检测方法：每孔加10 μL的MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h，弃掉上清，每孔加150 μL的DMSO，振荡、融解，于酶标仪（Tek Elx800，美国Biotek）上测量490 nm波长吸光值（OD490 nm）。本研究中细胞分组为：对照组（即si-CON组）、si-ANRIL组、si-p53组和si-ANRIL+si-p53组。 1.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力

将-80℃保存的BD基质胶取出，4℃过夜。取300 μL空培养液，加入60 μL基质胶，混匀，加入上室，在37℃无菌条件下放置6 h，使ECM胶充分凝固；消化细胞，制成细胞悬液，在凝固后的上室中每孔种2×105个细胞。下室加入含10%血清的无抗生素培养基，继续培养24 h后，将小室取出，用棉签擦拭去除上室内的细胞，以1%结晶紫染液将小室多孔膜下表面的细胞染色，显微镜下观察。

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1.4 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡

采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡比例，转染48 h后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，随后依次加入5 μL Annexin V和5 μL PI，混匀，室温避光孵育10 min，流式细胞仪（FACSCanto Ⅱ，美国BD公司）检测细胞凋亡比例。 1.5 Real-time PCR检测干扰效果

Trizol法提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA，SYRB Green法检测基因转录水平。ANRIL定量引物序列如下，F：TGCTCTATCCGCCAATCAGG；R：GGGCCTCAGTGGCACATACC。内参引物β-Actin序列如下，F：

TCATGAAGTGTGACGTGGACAT；R：CTCAGG-AGGAGCAATGATCTTG。ANRIL转录水平的相对变化用2-ΔΔCt法分析。 1.6 Western blot检测蛋白表达

在煮沸变性的蛋白样品中取30 μg蛋白加入预先制好的变性聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE胶）的加样孔中，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，小心将凝胶从玻璃板上剥下，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃结合一抗过夜，TST洗3次，室温结合二抗1 h，TST洗3次，ECL显影、曝光。 1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 lncRNA ANRIL在乳腺癌细胞中的表达

与正常乳腺上皮细胞MCF10A相比，三株乳腺癌细胞（MCF7、ZR751和MDA-MB-231）中ANRIL的表达水平均显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。 2.2 干扰ANRIL表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响

MDA-MB-231细胞中瞬时转染si-ANRIL。Real-time PCR结果显示，ANRIL被有效干扰（P < 0.05）。MTT结果显示，干扰ANRIL后细胞增殖显著减慢（P < 0.05）。Transwell实验结果显示，si-CON组穿膜细胞数显著高于si-ANRIL组的穿膜细胞数（P < 0.05），干扰ANRIL有效抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭能力。FCM分析结果显示，干扰ANRIL后细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）。见图2（封三）。

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2.3 干扰ANRIL表达对p53信号通路活性的影响

Western blot结果显示，干扰ANRIL后，p53表达水平显著升高（P < 0.05），p53经典下游靶基因p21的表达也显著提高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。 2.4 p53表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

MTT结果显示，与si-ANRIL组相比，si-ANRIL+si-p53组细胞增殖能力有显著恢复（P < 0.05）。细胞侵袭能力也有明显恢复（P < 0.05）。FCM分析结果显示，si-ANRIL+si-p53组在凋亡刺激条件（100 nmol/L化疗药物紫杉醇处理48 h）下细胞凋亡能力显著降低。见图4（封三）。 3 讨论

乳腺癌的发生机制复杂多样，目前尚未研究透彻，亟需探索新的分子标志物。lncRNA作为肿瘤研究领域中的新兴热点，在乳腺癌中的关注也与日俱增。研究发现，许多lncRNA在乳腺癌中表达发生变化，具有作为治疗靶点的潜力[4-5]。如，lncRNA MEG3在乳腺癌中表达下降，与患者预后密切相关[6]。H19在乳腺癌中高表达，促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和耐药[7-9]。Hotair发挥着类似癌基因的作用，与乳腺癌的转移、耐药及患者不良预后密切相关[10-12]。lncRNA在肿瘤中的重要作用使其逐渐成为分子生物学及临床医学研究的重要方向。 lncRNA ANRIL在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肝癌、肺癌等[13-15]。ANRIL在乳腺癌中表达也升高，但其在乳腺癌中的作用及相关机制仍待阐明。本研究首先验证了ANRIL在乳腺癌细胞中确实表达升高；接着分析了ANRIL的高表达对乳腺癌细胞作用，发现ANRIL可促进其增殖、侵袭，抑制凋亡；进一步探寻ANRIL调节乳腺癌细胞增殖、侵袭及凋亡的机制，并检测了改变ANRIL后基因表达改变情况，结果提示ANRIL可抑制p53信号通路；最后，证明了ANRIL对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡能力的调节作用的确是通过调控p53实现的。 ANRIL可抑制p53信号通路，但ANRIL如何参与调控p53，本研究尚未阐明。已知lncRNA可在多层面（表观遗传水平、转录以及转录后水平等）调控基因表达。如在表观遗传水平，lncRNA可通过招募组蛋白修饰酶，或者DNA甲基转移酶，改变靶基因的组蛋白修饰或DNA甲基化水平，从而诱导编码基因表达沉默[16-18]。在转录水平，lncRNAU1能通过RNA聚合酶Ⅱ的C末端结构域磷酸化，特异性结合和刺激转录因子TFIIH，从而诱导转录起始[19]；在转录后水平，某些lncRNA（如反义RNA）可与蛋白编码基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA剪切，或在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA，通过调节mRNA的剪接、降解和转录后翻译来调控基因表达[20]。已有研究发现，ANRIL的作用机制主要有两个方面：一方面ANRIL可与多梳抑制复合物2的核心亚基SUZ12、EZH2相互作用，介导组蛋白H3K27的三甲基化，沉默基因转录（如p15、miR-99a/miR-449a）；ANRIL沉默可干扰与p15结合的SUZ12，促进p15的表达，抑制肿瘤细胞增殖[21-22]；ANRIL也可与多梳抑制复合物1

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相互作用，催化H3K27三甲基化，沉默靶基因表达[23]。本研究中，ANRIL是否可通过与多梳抑制复合物1或2相互作用来抑制p53，有待后续进一步研究。

作为一类新型的具有生物学功能的临床标志物，lncRNA具有非常广阔的临床应用前景，对疾病的发生、发展及治疗有重要作用。本研究的结果将有助于进一步认识lncRNA ANRIL在乳腺癌中的重要作用，有望成为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗的有效靶点，对后续的科研有进一步的指导意义。 [参考文献]

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