中国实用神经疾病杂志２０１３年６月第ｌ６卷第１ｌ期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｊｕｎ ２０１３，Ｖｏ１．１ ６ Ｎｏ．１１ ・７・ ｓｔａｂｌｅ ａｎｇｉｎａ ｏｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎ ｆａｒｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ， ２００２，８９：１４５． ［１ ６］ Ｈｏｔｈ ＫＦ，Ｈａｌｅｙ ＡＰ，Ｇｕｎｓｔａｄ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｖａｔｅｄ Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｏｌｄｅｒ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｒ ［１ｏ３ 刘字庆，薛恒．血清Ｃ反应蛋白水平与急性脑出血病情及预 ｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ￣．Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ，２００８，５６：Ｉ ８９８． ［１７］ Ｋｏｍｕｌａｉｎｅｎ Ｐ，Ｌａｋｋａ ＴＡ，Ｋｉｖｉｐｅｌｔｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｕｍ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃ—ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ 后的关系［Ｊ］．中国中西医结合急救杂志，２ｏ１ｌ，１８（６）：３４７— ３４９． ［１Ｉ］ Ｃａｓｔｉｌｌｏ Ｊ，Ｄａｖａｌｏｓ Ａ，Ａｌｖａｒｅｚ—ｓａｂｉｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａ— ｔｕｒｅｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ［Ｊ］．Ｎｅｕ— ｒｏｌｏｇｙ，２００２，５８：６２４．． ｗｏｍｅｎＥＪ］．Ａｇｅ Ａｇｅｉｎｇ，２００７，３６：４４３． ＪＭ，Ｍａｎｌｙ ＪＪ，Ｓｃｈｕｐｆ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ—ｒｅａｃ ［１８Ｊ Ｎｏｂｌｅｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ［Ｊ￣．Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ，２０１０， ６７：８７． ［１２］ Ｄｉ Ｎａｐｏｌｉ Ｍ，Ｐａｐａ Ｆ，Ｂｏｃｏｌａ Ｖ．Ｃ—ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ：ａｒｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，２００１，３２ （４）：９１７－９２４． ［１９］ Ｋｎｏ ＨＫ，Ｙｅｌｌ Ｃ－Ｉ，Ｃｈａｎｇ ＣＨ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ—ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｓｔｒｏｋｅ，ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ａｎｄ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ［１３］ Ｃａｎｏｖａ ＣＲ，Ｃｏｕｔｉｎ Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｔ ＷＨ．Ｃ—ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｉ ａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２００５，４：３７１． ｉｓｚｅｗｓｋｉ ＭＡ，１ ｉ ＳＨ，ｅｔ ａ１．Ｃ—ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ［２０］ Ｖｅｒｍａ Ｓ，Ｋｕｌ（ＣＲＰ）ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏ—ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｖｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１ ９９９， １４７：４９－５３． ［１４］ Ｄｚｉｅｄｉｃ Ｔ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａ１．ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ。ｎ． ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ １ｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃ— ｓｔｒｏｋｅ ｐａｔｉｅｎｔ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ，２００８，１３：２ ９２２． ［ｉ５］ 李继珍，李昕，胡存昆，等．脑血管患者认知功能与病灶部位、 ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００４，ｌ０９：２ ０５８． （收稿２０１３－０３ ２９） 体积的关系［Ｊ］．徐州医学院学报，２００８，２８（１２）：７９７－８００． ＴＬＲ４一Ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路在ＬＰＳ诱导ＢＶ２细胞中的表达及意义 吴 非 ’ 罗 涛” 郭远瑾” 梅元武”△ １）华中科技大学协和医院神经内科 武汉４３００２２ ２）广州军区武汉总医院神经内科 武汉４３００７０ 【摘要】 目的观察ＬＰＳ诱导小胶质细胞后信号通路Ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ４）一ｐ３８蛋白激酶（ｐ３８ＭＡＰＫ）的表达及意义。 方法 体外培养ＢＶ２小胶质细胞，分为对照组、ＬＰＳ诱导组（ＬＰＳ刺激１２ ｈ及２４ ｈ）及ＳＢ２０３５８０干预组（ＬＰＳ＋ＳＢ２０３５８０诱 导１２ ｈ及２４ ｈ），应用ＥＬＩＳＡ法检测各组ＴＮＦ－ａ、ＩＬ一６水平，ＲＴ—ＰＣＲ法检测各组ＴＩ Ｒ４ ｍＲＮ『Ａ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ的表达 变化。结果ＬＰＳ诱导组细胞分泌ＴＮＦ一“、ＩＩ ６水平显著提高。诱导２４ ｈ后细胞上清液含量分别为（５１３．６７±ｌ４．０５）ｐｇ／ｍｇ 和（３９６．８４±１５．４１）ｐｇ／ｍｇ。给予ＳＢ２０３５８０抑制剂后ＴＬＲ４ ｍＲＮＡ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｔｕＲＮＡ表达明显减弱，细胞分泌ＴＮＦ一“、 ＩＩ 一６含量表达与感染组比较也明显降低。结论Ｉ．ＰＳ刺激小胶质细胞可引起ＴＬＲ４一ｐ３８ ＭＡＰＫ信号通路的活化并释放炎性 细胞因子，而ＳＢ２０３５８０则对其有明显的抑制作用，证明ＴＩ Ｒ４一ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路与小胶质细胞的炎性活化密切相关。 【关键词】ＴＩ Ｒ４一Ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路；小胶质细胞；ＬＰＳ；ＳＢ２０３５８０ 【中图分类号】Ｒ ３３２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号１ １６７３～５１１０（２０１３）ｌ１－０００７ ０３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＴＬＲ４＿・Ｐ３８ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ＬＰＳ＿・ｉｎｄｕｃｅｄ ＢＶ２ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ Ｗｕ Ｆｅｉ，Ｌｕｏ Ｔａｏ，Ｇｕｏ Ｙｕａｎｊｉｎ，Ｍｅｉ Ｙｕａｎｗｕ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００２２，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＴＬＲ２ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐ３８ ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＬＰＳ—ｉｎｄｕｃｅｄ ＢＶ２ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ＢＶ２ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ＬＰＳ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｌａｓｔｉｎｇ １２ ａｎｄ ２４ ｈｏｕｒｓ）ａｎｄ ＳＢ２０３５８０ ｐｌｕｓ ＬＰＳ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｌａｓｔ ｉｎｇ ｌ２ ａｎｄ ２４ ｈｏｕｒｓ）．Ｗｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＴＮＦ ａｌｐｈａ ａｎｄ ＩＩ 一６ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＴＬＲ４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ ｂｙ ＲＴ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｔ１ Ｒ４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ。ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｏｂｖｉ— ＯＵＳ ａｆｔｅｒ ２４一ｈｏｕｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ＴＮＦ—ａ ｗａｓ（５１３．６７±１４．０５）ｐｇ／ｍｇ，ＩＬ一６ ｗａｓ（３９６．８４±１５．４１）ｐｇ／ｍｇ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＳＢ２０３５８ｏ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ＴＩ Ｒ４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐ３８ ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ＢＶ２ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＴＮＦ－ａ ａｎｄ ＩＩ ６ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔ１ｉｅ ＴＩ Ｒ４一ｐ３８ ＭＡＰＫ ｓｉｇ ｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｃａｎ ｂｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ｉｎ ＢＶ２ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ａｎｄ ｔｈｅ ＳＢ２０３５８０ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＴＩ Ｒ４一ｐ３ ８ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＴＩ Ｒ４一ｐ３８ＭＡＰＫ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ；Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ；ＬＰＳ；ＳＢ２０３５８０ 本实验通过ＬＰＳ体外诱导小胶质瘤细胞ＢＶ２细胞模拟 细菌对小胶质细胞的激活，并给予特异性ｐ３８蛋白激酶 （ｐ３８ＭＡＰＫ）的抑制剂，观察ＴＬＲ４一Ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路的 变化及对炎症介质的影响，对ＴＬＲ４／ｐ３８ＭＡＰＫ信号传导 机制与感染炎症反应的关系进行初步探讨。 １材料与方法 △通迅作者：梅元武，Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｅｉｙｕａｎｗｕ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ ・８・ 中国实用神经疾病杂志２０１３年６月第１６卷第１１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｊｕｎ ２０１３，Ｖｏ１．１６ Ｎｏ．１１ １．１材料ＢＶ２细胞购买于中国科学院基础医学细胞中 心，无菌ＰＢＳ、ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清等细胞培养所需主 要试剂均为ＨｙＣｌｏｎｅ公司。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（实时荧光定量） 相关试剂盒购买于大连ＴａＫａＲａ公司，鼠ＥＬＩＳＡ试剂盒 ＴＮＦ＿ 、ＩＬ－６均为欣博盛科技有限公司产品。ｐａ８ＭＡＰＫ特 异性抑制剂ＳＢ２０３５８０（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ公司），以二甲基亚砜 （ＤＭＳＯ）溶解，使用前以生理盐水稀释，使ＤＭＳＯ的终浓度 为２ ，ＳＢ２０３５８０的终浓度为５ ｍｇ／ｍＩ 。 １．２方法 １．２．１ ＢＶ２细胞的体外培养：ＢＶ２细胞用含１０ 胎牛血清 的高糖ＤＭＥＭ培养基在３７℃、５ ＣＯ 细胞培养箱中进行 培养，隔１～２ ｄ换新培养液，当ＢＶ２细胞生长到８Ｏ 时，按 １：３进行传代。 １．２．２细胞处理：将ＢＶ２细胞以８×１Ｏ 的密度接种于２４ 孔板内，于３７℃、５ ＣＯ 培养箱中继续培养，２４ ｈ后镜下观 察细胞贴壁达到６Ｏ 时，向各孔中加入分别为感染组（ＬＰＳ 刺激１２ ｈ、ＬＰＳ刺激２４ ｈ）、阻断组（ＬＰＳ＋ＳＢ２０３５８０刺激１２ ｈ、ＬＰＳ＋ＳＢ２０３５８０刺激２４ ｈ）、对照组（无菌ＰＢＳ），每组取５ 个样本，相应时间后观察细胞形态并收集上清液以备进行细 胞因子的测定。 ８ ７ ６ ５ 裁４ 漆 ３ ２ １ ０ １．３ ＥＬＩＳＡ法检测细胞培养上清ＴＮＦ—ａ、ＩＩ，６含量 收集 细胞上清液，按照试剂盒说明书检测水平，显色后在酶标仪 ４５０ ｒｉｍ处测吸光度值，建立标准曲线，根据标准曲线计算含 量。 １．４细胞ＴＬＲ４ ｍＲＮＡ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达 使用总 ＲＮＡ小量制备试剂盒提取细胞总ＲＮＡ。采用 ＡＲＡ逆转 录及实时荧光定量试剂盒检测ＴＬＲ４和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ的表 达，以三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＤｌＰＨ）作为内参对照。反应参 数：９５℃变性４ ｍｉｎ；９５℃３０ ｓ，５５℃１、 ｍｉｎ，７２℃１ ｒｎｉｎ，３５个循 环；７２℃延伸５ ｍｉｎ。小鼠ＴＬＲ４引物序列如下：Ｆ：ＧＧＣＡＧ ＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴ，Ｒ：ＣＣＡＡＧＴＴＧＣＣＧＴＴＴＣＴＴ— ＧＴＴ；ｐ３８ ＭＡＰＫ引物：Ｆ：ＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣＡＡＡＡＧ— ＧＡＣ，Ｒ：ＡＧｃＴＴｃＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡｃＧＡＴ；内参ＧＡＰＤＨ引 、 物：Ｆ：ＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡ，Ｒ：ＧＣＣＣＣＴＣＣＴ— ＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ。每个样本设置３个复孑Ｌ，ＣＴ值代表荧 光实时定量ＰＣＲ的结果，△ｃＴ ＣＴ（目的基因）一ｃＴ（内参 基因），ＡＡＣＴ＝ＡＣＴ（实验组）一△ＣＴ（对照组）。根据公式可 以算出各组细胞中目的基因表达／对照组细胞中目的基因表 达＝２一ＡＡＣＴ。 １．５统计学处理所有数据采用ＳＰＳＳ １３．０统计软件进行 分析。实验结果符合正态性分布，所有数据均以均数±标准 差表示，组间和组内比较采用单因素方差分析，组间比较用ｑ 检验，组内比较用ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１细胞ＴＬＲ４ ｍＲＮＡ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达变化 从图１中可见ＬＰＳ刺激ＢＶ２后ＴＩ Ｒ４ ｔｕＲＮＡ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达与空白组比较有明显升高，２４ ｈ组较１２ ｈ组明 显表达升高，ｐ３８ＭＡＰＫ特异性抑制剂ＳＢ２０３５８０对小鼠脑 组织ＴＬＲ４ ｍＲＮＡ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达有明显抑制作 用，与感染组比较均明显降低。 ２．２细胞因子ＴＮＦ—ａ、ＩＩ 一６的含量 从表１中可见与对照 组比较，ＴＮＦ－ａ、ＩＬ一６含量在１２、２４ ｈ均高于对照组。２４ ｈ较 １２ ｈ升高明显。而ＳＢ２０３５８０干预组与感染组比较，ＴＮＦ—ａ、 ＩＩ 一６表达水平均低于感染组，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。 ｝ 一ｋ 与对照组比较， Ｐ＜０．０５；与同时间感染组（ＬＰＳ组）比 较， Ｐ＜０．０５ 图１各组细胞ＴＬＲ４ ｍＲＮＡ和ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达变化 表ｌ 各组不同时间点ＴＮＦ一“、ＩＬ一６ 含量比较（ 一３，ｐｇ／ｍＩ ， ±ｓ） 组别 ＴＮ ａ含量 ＩＩ 一６含量 Ｉ 组 ３０２．６５＋＿８．３９＃５１３．６７ｆ１４．０５ ２６３．３７￣Ｉ２．３４ ３９６．８４±Ｉ５．４１＃ Ｕ］ｓ＋ｓＢ２０３５８０组３９４．７４１９．０３ ４１４．２３１６．２５ ２９２．５４１３８．６６ ３０７．００１１２．１７ 对照组 １５８．２６￣４．３５ １６７．９－７．７１ １８２．３９１５．９５ １７４．８９＋＿６．５３ 注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５；与感染组比较， Ｐ＜０．０５ ３讨论 细菌性脑膜（脑）炎是常见的中枢神经系统感染疾病，病 原体侵袭中枢神经后，引起强烈的脑膜（脑）炎性反应，内毒 素即ＬＰＳ是引起的重要因素之一。ＬＰＳ进入体内后，除本 身对可激活血小板、中性粒细胞、巨噬细胞以及补体系统和 凝血系统等，促使内源性介质释放和炎症因子的过度分泌， 造成各组织的损伤 ｊ。当侵袭中枢导致病情迅速演变并损 伤血管内皮细胞，血脑屏障通透性增加，产生血管性水肿，释 出毒性物质＿２。］。炎症不能得到控制，则将会产生严重脑水 肿，进而导致神经元损害，发生不可逆转的局灶性或弥散性 脑损害。Ｔｏｌｌ样受体是胞膜模式识别受体，主要表达在参与 宿主防御功能的细胞上，ＴＬＲ４是最具代表性的ＴＬＲｓ受 体，通过识别各种病原微生物的相关分子模式，通过偶联信 号传导途径激活天然免疫细胞，最终导致一系列的免疫炎症 反应 ］。ＴＬＲｓ—ＭｙＤ８８／ＩＲＡＫ一丝裂原活化激酶途径是其中 的重要传导途径之一，丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）主要介 导细胞发生分化、增殖、死亡、功能同步化等多种生理过程， 与细胞生存有重要关系 Ｊ。ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路也是应激激 活的ＭＡＰＫ通路之一，在炎症反应和调解中起重要作 用ｌ６ ］。ＴＮＦ—ａ、ＩＬ一６含量的高低可在一定程度上反映病情 的变化－８］。ＬＰＳ刺激免疫细胞均可有效激活细胞内 ｐ３８ＭＡＰＫ，进而诱导ＴＮＦ一Ⅱ、ＩＬ一６、ＩＬ－１０等显著增加［９］，在 小鼠肺炎衣原体模型中ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂可明显下调多种 炎症因子的基因表达，可有效抑制ＬＰＳ诱导活化。同时， ＮＦ—ｄ、ＩＩ ６也明显减少，提示ｐ３８ＭＡＰＫ是ＬＰＳ诱导人类 炎性反应的重要信号环节＿１ 。本实验中，我们用ＬＰＳ刺激 ＢＶ２模拟细菌感染胶质细胞，研究发现可引起ＴＬＲ４ ｍＲ— ＮＡ、ｐ３８ ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达明显增高，２４ ｈ更加明显，相应 引起炎症介质ＴＮＦ－￣、ＩＩ ～６升高，表明炎症早期介质ＴＮＦ ａ、 ＩＬ一６参与了细菌感染后的病理生理过程；同时也证明 中国实用神经疾病杂志２０１３年６月第１ ６卷第１Ｉ期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｊｕｎ ２０１３，Ｖｏ１．１ ６ Ｎｏ．１１ １ １３６． ・９・ ＴＬＲ４一Ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路在细菌感染的信号传导中起着重 要作用。同时，我们用特异性抑制剂ＳＢ２０３５８０进行干预，相 应地影响ＴＩ Ｒ４ ｍＲＮＡ表达以及信号中游ｐ３８ＭＡＰＫ ｍＲ— ［４３ 刘雪燕，徐勇．Ｔｏｌｌ样受体４与脓毒症相关性的研究进展［Ｊ］． 中国生物制品学杂志，２０１２，２５（１２）：１ ７２３—１ ７２８． ，Ｓａｋｌａｔｖａｌａ Ｊ．Ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａ ［５］ Ｃｌａｒｋ ＡＲ，Ｄｅａｎ Ｊ１ｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐ３８ ＮＡ表达，并使下游因子ＴＮＦ—ａ、ＩＬ一６的释放减少，表明 ＴＬＲ４一ｐ３８ＭＡＰＫ信号传导途径与炎性反应密切相关，同时 与ＴＮＦ—ａ、ＩＬ一６因子密切相关。 ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００３，５４６：３７—４４． 综上所述，ＴＬＲ４一ｐ３８ＭＡＰＫ信号传导途径参与了细菌 性脑炎的发生发展过程中，ｐ３８ＭＡＰＫ在信号传导中起着重 要作用，针对控制ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ及相关通路可能成为临 床上防治细菌性脑炎的一个新思路，同时细胞内的许多信号 ［６］ Ｋａｎｇ ＹＪ，Ｓｅｉｔ Ｎｅｂｉ，Ｄａｖｉｓ ＲＪ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐ３８ａｌｐｈａ ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００５，２８１：２６ ２２５—２６ ２３４． ［７］ Ｘｕ ＧＩ ，Ｙａｏ Ｉ ．Ｒａｏ ＳＹ，ｅｔ ａ１．Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｍｉｃｅ ｂｙ ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏ 传导与细菌感染及炎症的发生发展密切相关，还有待研究者 得进一步认识。 ｒｙｌａｔｅｄ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒ— ｍａｃｏ，２００５，９８（１／２）：１７７． ［８３ 侯铁民．颅脑损伤患者血清炎性因子的变化规律研究［Ｊ］．中 ４参考文献 ［１］王华东，陆大祥，黄启福．内毒素性休克的分子机制与中药防 治［Ｊ］．中国中西医结合杂志，２００４，２４（１）：８７—９０． ［２］ 彭镜，尹飞，甘娜，等．内毒素脂多糖对体外血脑屏障模型通透 性的影响及其机制研究［Ｊ］．中华医学杂志。２００６，８６（２７）：１ ９２４ １ ９２６． 国医药指南，２０１２，１０（２７）：５８１—５８２． ＰＳ，Ｈｕａｎｇ ＹＨ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ４， ［９］ Ｌｅｅ ＰＹ，Ｔｓａｉｎｕｃｌｅａｒ｛ａｃｔｏｒ－ｇＢ ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎ——ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｌｉｇｎｏ— ｃａｉｎｅ ｍａｙ ｉｎｖｏｌｖｅ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，３５（９）：１ ０５２—１ ０５８． ［ｉｏ］ 施毅，董静，印洁，等．ＴＩ Ｒ２一ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路在小鼠肺 炎衣原体肺炎中的表达及意义［Ｊ］．中国呼吸与危重监护杂 志，２０１１，ＩＯ（５）：４３２—４３６． （收稿２０１３－０２ ２５） ｎ Ｆｅｉ，Ｐｅｎｇ Ｊｉｎ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｅ３］ Ｈｅ Ｆａｎｇ，Ｙｉｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉ ｅｓ［ｊ］．Ｊ Ｃｅｎｔ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖ，２０１０，３５（１１）：１ １２９一 ＰＰＡＲ 在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用 李安秦” 刘 娟 狄政莉”△ 田 晔” 曹 磊 ２）消化科 西安７１０００３ 西安市中心医院 １）神经内科【摘要】 目的初步观察过氧化物酶体增生物激活受体６（ＰＰＡＲ３）激动剂ＧＷＳ０１５１６预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤 的影响，探讨ＰＰＡＲ８在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法选用健康Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠７２只，随机分为假手 术组、模型组和ＧＷＳ０１５１６预处理组。采用大鼠大脑中动脉闭塞２ ｈ再灌注模型。ＧＷ５０１５１６预处理组大鼠在致伤前３０ ｍｉｎ 给予颅内注射１０ ｇ／ｆｆＬ的ＧＷ５０１５ｌ６。于缺血再灌注损伤后２４ ｈ，通过神经功能缺损评分监测神经功能缺损情况；通过２，３， ５一氯化三苯基四氮唑（ＴＴＣ）染色测定脑梗死面积；通过干湿重法检测脑水含量；通过ＴＵＮＥＬ方法观察各实验组鼠脑缺血半 暗带神经细胞的凋亡。结果 与模型组相比，缺血再灌注损伤后２４ ｈ，ＧＷ５０１５１６治疗组神经功能缺损评分（Ｐ＜０．０５）、脑梗 死面积（Ｐ＜Ｏ．０５）、脑水含量（Ｐ＜０．０１）和缺血半暗带神经细胞凋亡（Ｐ＜０．０１）均明显低于模型组。结论 ＰＰＡＲａ激动剂 ＧＷ５０１５１６对大鼠缺血性脑损伤有明显保护作用，抗凋亡作用可能是ＧＷＳ０１５１６发挥保护作用的机制之一。 【关键词】ＧＷ５０１５１６；过氧化物酶体增生物激活受体；缺血性脑损伤；凋亡 【中图分类号】Ｒ ３３２ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号１ １６７３ ５１１０（２０１３）１１－０００９—０３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ６ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊ ｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ Ｌｉ Ａｎｔａｉ ，Ｌｉｕ Ｊｕａｎ，Ｄｉ Ｚｈｅｎｇｌｉ，Ｔｉａｎ Ｈｕａ，Ｃａｏ Ｌｅｉ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｘ ’ａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｘ ’ａｎ ７１０００３，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＧＷ５０１５１６ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａ ＰＰＡＲ３ ａｇｏｎｉｓｔ，ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｅｖｅｎｔｙ－ｔｗｏ Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ，ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕ— ｓｉｏｎ（ＭＣＡＯ）ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＧＷ５０１５１６ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ．ＧＷ５０１５１６ １０ ｆｆｇ／ｆｆＬ ｗａｓ ｉｎｔｒａｅｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ３０ ｍｉｎｕｔｅｓ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ＧＷ５０１５１６ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｒａｔｓ．Ａｔ ２４ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ—ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔ ｓｃｏｒｅ（ＮＤＳ），ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ２，３，５－ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ） ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｂｒａｉｎ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｄｒｙ ａｎｄ ｗｅｔ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ，ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｂｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ—ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｔ ２４ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｉｓｅｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＭＣＡ０ ｇｒｏｕｐ ｒａｔｓ，ＮＤＳ（Ｐ＜０．０５），ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ（Ｐ＜０．０５），ｂｒａｉｎ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｐ＜０．０１）ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ １ｏｗｅｒ ｉｎ ＧＷ５０ｌ５１６ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｒａｔｓ ａｔ ２４ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊ ｕｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＧＷＳ ０ １ ５ １ ６ ｈａｓ ａ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ 基金项目：陕西省自然科学基金（２０１０ＪＭ４０３２） △通讯作者：狄政莉，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｌｉｄｉ＠ｌ２６．ｃｏｎｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＧＷＳ０１５ｌ６ ｍａｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ａ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊ ｕｒｙ．
