小麦不同部位蛋白全程研究过程简介

1.1小麦叶片蛋白质组提取

采用TCA／丙酮沉淀一酚／SDS联合抽提法来提取小麦叶片蛋白。参照Wang等 [1]方法，加以改进。取新鲜的小麦叶片1g，液氮中迅速研磨成细粉，加入10mI于一20℃预冷的提取介质[10 TCA(w／V)丙酮溶液+0．2 DTT]，反复颠倒混合，一20℃ 沉淀2 h或过夜；4℃ ，16 000×g离心10 min，弃上清；沉淀用含100mmol／I 醋酸铵的80 甲醇溶液洗1次，80 丙酮洗1次，通风橱内室温干燥10 min；加入10mI 酚／SDS抽提夜[-pH 8．0 Tris饱和酚与SDS缓冲液(30 蔗糖、2 SDS、5 J3一巯基乙醇、0．1mol／[ pH 8．0 Tris—Hc1)1：1}昆合]振荡混匀温育5 min，4℃ ，16 000×g离心10 min，转移上层酚相至一干净新管中，加入5倍体积的冷的含100mmol／I 醋酸铵的甲醇溶液，一20℃ 沉淀4 h或过夜；4℃ ，16 000×g离心lOmin，弃上清液，沉淀用甲醇洗1次，80 丙酮洗1次，通风橱内自然风干，～ 80℃ 冰箱保存备用。 1.2 小麦胚乳蛋白的提取 赵[2]选用TCA-丙酮法，抽穗时选取同一天抽穗挂牌标记，抽穗后10 d取挂牌标记的5个穗，取穗中上部灌浆一致的籽粒，剥去颖壳置于冻存管中-80 ℃保存。取冻存籽粒20粒，用灭菌预冷的剪刀和镊子在预冷的研钵中迅速剥去种皮，切去胚，加0.2% PVP迅速研磨至糊状，悬浮于含0.07% DTT的预冷10%TCA-丙酮，-20 ℃过夜。次日4 ℃ 35 000 r·min-1离心15 min， 弃上清， 将沉淀重悬于80%丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃ 16 000 r·min-1离心15 min。沉淀重悬于100% 丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃16 000 r·min-1离心15 min。重复此步骤2~4次，倒出上清液，离心管置于冰浴中抽真空15 min至丙酮完全挥发，得到的蛋白为粗蛋白。 1. 双向电泳技术

1.1 小麦叶片蛋白质组双向电泳技术

参照李[3]采用SDS—PAGE和双向凝胶电泳30 mg蛋白粉加入300 FI 水化上样缓冲液(8mol／I 尿素、4 CHAPS、65 mmol／I DTT、0．2V／V BioIyte)，37℃水浴30 min，6℃ ，40 000×g离心30 rain，取上清液，Bradford法测定蛋白浓度 。SDS—PAGE电泳上样量为100 mg，蛋白样品与2×电泳上样缓冲液等体积混合，直接在12 的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，胶体考染口 ，用普通凝胶成像系统(Bio—Rad，美国)采集图像。双向电泳采用BioRad公司电泳系统(Protean IEF cell等电聚焦系统、PR()TEAN 11 xi Cell垂直电泳系统、Mini pro—teanⅢ cell垂直电泳系统)，蛋白上样量为：7 cm胶条200 Fg、17 cm胶条5OO Fg。等电聚焦和向第二向SDS—PAGE的转移参照Bio—Rad操作指南进行。IPG胶条为7、17 cm(pH值3～10、4～7，Bio—Rad)，第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为12 。染色采用胶体考马斯亮蓝染色方法l1 。UMAX Power—I．ook 2100XI 型光密度扫描仪(Bio—Rad，美国)，分辨率设为300dpi采集图像。每种蛋白提取方法的双向电泳进行3次重复。PDQuest 7．4软件(BioRad，美国)对图像进行分析。 2.2 小麦胚乳蛋白的双向电泳 对小麦胚乳采用以下技术进行电泳如赵[4]. 样品被动上样及等电聚焦, 选用17 cm IPG胶条（pH 4~7）。IPG干胶条胶面朝下放入水化液的水代盘中，覆盖一层矿物油以防止等电聚焦时尿素析出，蛋白氧化及产生冷凝水，被动水化14 h 后，置于Bio-Rad 等电聚焦仪中，等电聚焦在20 ℃条件下自动进行，每胶条限流50 μA。等电聚焦参数如下：① 500 V 4 h 除盐；② 1 000 V 1 h 线性上升（Gra）；③ 8 000 V 2.5 h 线性上升（Gra）；④ 8 000 V 0.5 h 聚焦。胶条的平衡, 将等电聚胶后的胶条胶面向上置于5 mL平衡缓冲液Ⅰ（50 mol·L-1 Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-1urea， 30%甘油， 2% SDS， 0.002% 溴酚蓝， 1%DTT）中平衡摇床震荡15 min，然后再置于5 mL平衡缓冲液Ⅱ（50 mmol·L-1 Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-urea，30%甘油，2% SDS，0.002% 溴酚蓝，2.5%碘乙酰胺）中平衡15 min，取出后放在湿润的定性滤纸上，以吸去表面多余的液体。SDS-PAGE, 采用Bio-Rad 垂直电泳系统， 胶的浓度为12%，

将平衡后的胶条放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面上，用0.5%的低熔点琼脂糖封顶液封闭排除气泡。在电泳槽中加入约1.5 L 电泳缓冲液（0.025 mol·L-1 Tris，0.192 mol·L-1 Glyeine，0.1%SDS）第一步每块胶10 mA下电泳30 min，第二步每块胶20 mA下电泳至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0.5 cm时停止电泳。考马斯亮蓝染色, 电泳后将凝胶立即放入固定液（40%甲醇，l0%乙酸）中至少30 min，可过夜；充分固定后用Millipore纯净水洗2次，每次5 min；换置考马斯亮蓝染液（10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，0.06%考马斯亮蓝G250染色，至少2 h；用脱色液（25%乙醇，8%乙酸）脱去底色，或者直接用Millipore纯净水脱色，直到蛋白点清晰为止。

3 . 蛋白质鉴定

3.1 小麦叶片蛋白质鉴定采用以下技术。蛋白质组分通过双相电泳等分离技术分离后，必须通过适当技术鉴定，才能知道蛋白质组成分的性质、结构和功能及其各蛋白质间的相互作用关系，从而最终实现蛋白质组表达模式和功能模式的研究。 3.1.1 以质谱为基础的分离鉴定技术

3.1.1 .1同位素亲和标签技术（isotope-coded-affinitytag, ICAT）ICAT 技术是质谱用于差异蛋白质组的典型技术，最早是由Gygi 等发展运用起来的。ICAT 技术的关键是其同位素标记的带有生物素的巯基烷化试剂，其结构主要由三部分构成:(1)亲和标签(一种生物素，biotin)，用来分离ICAT 标记多肽的基团；(2)连接子，用来整合稳定的同位素，可以引入8 个氢原子或8 个氘原子；(3)活性基团，专一的化学反应基团(与蛋白质的Cys 的一SH专一反应)。根据引入8 个氢原子或8 个氘原子的不同，ICAT 试剂分为轻型和重型两种。两者分子量相差8u。当对两种蛋白样品比较分析时，用ICAT 标记样品, 将两个样品混合、酶解后, 通过生物素的亲和层析将标记的肽段分离出来,对生物素ICAT 标记的酶解片断进行在线HPLC-MS/MS 分析，经二级MS/MS 鉴定出该肽段属于何种蛋白后, 由峰的相对强度对该蛋白在不同样品中的含量进行相对定量而找出两种样品中同一种蛋白质表达的差异。该方法具有许多优点，它可直接对混合样品(来自正常和病变细胞或组织等) 进行分析；另外，通过只分离含有半胱氨酸的肽混合物，使其分析的复杂性大大降低；对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定,尤其是膜蛋白等疏水性蛋白；还可快速找出重要功能蛋白质如疾病相关蛋白质及生物标志分子,进而快速用于疾病诊断。Brand 等应用该技术研究小鼠红细胞分化过程中转录因子F-E2P18/MafK 的表达变化情况，结果表明ICAT 技术具有灵敏的鉴别能力[4]。Gygi 和Rist 等采用ICAT结合2D 色谱—质谱的方法, 对含有半胱氨酸的低丰度蛋白进行了准确的定量与鉴定[5]。但ICAT 在定量及差异表达检测上也存在一些缺陷。如无法检测不含半胱氨酸的蛋白质；其次，半胱氨酸残基必须位于易处理的位置上，否则没有足够的氨基酸提供必须的鉴定信息；ICAT 标记的分子(分子量约500Da)相当大的修饰使数据库搜索的算法复杂化；另外则与氧化容易混淆，所以应用范围有一定的局限。目前，Aebersold 及其同事发展了一种固相同位素标签技术，与传统ICAT 技术相比，优点在于：含有半胱氨酸肽段的分离和蛋白质的标记在一步内完成，减少了实验步骤；肽段以共价键与固相物体表面结合，能够经受强烈的洗脱条件以除去非共价结合的肽段；实验不受蛋白质裂解酶、强去垢剂以及尿素等的影响，标签的质量较小和呈中性，观察到的肽段不易被忽略。

3.1.1 .1 蛋白质芯片质谱技术蛋白质芯片以蛋白质或多肽为材料，能同时从微量的样品中检测大量的蛋白质或多肽，是一个快捷、高效、并行、高通量的蛋白质分析技术。目前常将蛋白质芯片和表面增强的激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)相结合来研究差异表达蛋白质。其原理是将从细胞或体液中提取出的蛋白质混合物与一系列不同性质的蛋白质芯片相结合,洗去未结合的蛋白质,然后用质谱读出与芯片结合的蛋白质, 就得到了基于不同相互作用的蛋白质图谱,比较不同样本的质谱图,寻找差异蛋白。这种蛋白质芯片质谱技术最本质的优点是通过表面选择性吸附大大降低了蛋白质的复杂性，又能对多样品平行分析，从而

把每个蛋白放在一个具有相互参照价值的背景里。同时它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等。另外，各种芯片所收集的蛋白具有不同的等电点、金属结合能力以及疏水特性，这使研究者在分子质量之外得到了额外的信息，通过使用高通量的MALDI-TOF 检测，能够快速可靠地识别蛋白质，因此在差异蛋白质组的研究中获得较多青睐。Petricoin 等用蛋白质芯片技术从卵巢癌病人的血清中筛选出了5 个标志蛋白，对临床样品的检测灵敏度达100%[6]。Brynmor 等采用SELDI -TOF 技术在乳腺癌患者的血清中发现了NMP66 , 为公认的乳癌诊断标记物。但是蛋白质芯片技术在应用于寻找差异表达蛋白质时也具有局限性, 如待检测的低丰度蛋白往往被高丰度蛋白所掩盖而不能检测出来。

3.1.2 蛋白质和多肽的N 端、C 端氨基酸序列分析在蛋白质鉴定方面,质谱技术已基本取代传统的dman 降解法，但依托Edman 降解法的N 端氨基酸序列分析技术仍发挥着重要作用。它利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质。该方法精确性高,但测序速度较慢,且费用偏高,仅适用于分析少量差异表达蛋白质位点。 3.2 小麦胚乳蛋白的鉴定

3.2.1 De novo 测序和数据库搜索相结合

De novo 测序是一种直接解释串联质谱数据的方法. 每个串联质谱峰对应一对肽键的裂解，通过确定质谱中峰的离子类型可以得到这个峰对应肽段的前缀或后缀子序列的质量. 理论上，可以根据串联质谱中信号强度高的碎片离子之间的质量差和母离子信号确定离子类型，得到相应的b 离子、y 离子或其他离子峰. 然后通过计算相邻的同类型碎片离子之间的质量差获得肽段的全长序列[5].De novo 测序通过串联谱中的信息重建肽段序列，不受已知蛋白质或基因组数据库所包含信息的影响，在下面几个情况下体现了它在鉴定新蛋白质领域中的灵活性：a. 基因组测序不完全而使得数据库中未包含待鉴定的蛋白质序列；b. 基因测序和预测软件中的错误，导致预测的蛋白质数据库中没有对应序列或对应蛋白质序列不正确；c. 基因的可变剪接体翻译得到的新蛋白质序列、编码区单核苷酸多态性引起的不同蛋白质变体，以及含修饰信息的序列等，这样的序列在数据库中都没有对应条目.在上述情况下数据库搜索方法往往为力，而de novo 测序则提供了一种可能的方法. 实际应用中de novo 测序的通量极低，并且得到的肽段序列仍需通过序列比对找到与其功能或序列同源的蛋白质才有意义. 一般的谱图通过de novo测序只能得到少数可靠性较高的短片段，与后续其他手段结合才能达到鉴定蛋白质的目的. 因此，常将de novo 测序和序列比对相结合来鉴定新蛋白质.按照产生短序列标签方法的不同具体分2 种：a. 应用同位素标记得到序列标签.在样品预处理过程中加入诸如13C、18O 和15N等同位素标记，例如分离后的蛋白质在含有18O 环境中用胰岛素酶酶解，18O 原子会选择性标记C 端羟基集团[6]. 随后经MS/MS 碎裂，通过手工或软件解读串联谱图，根据谱图上特定离子固定质量单位的偏移读出对应序列，组装成肽段序列标签再进行下一步的数据库搜索.Matis 等[7]研究某菌类的蛋白质组时，该物种的基因组尚未测序. 将样品在16O 和18O 含量为1∶1 的水中酶解进行同位素标记，分别经2 种不同的ESI-QTOF (QTOF： quadrupole time-of-flight massspectrometer，四极杆- 飞行时间串联质谱仪)质谱仪测序，按照18O 标记的规则手工解读谱图得到有同位素标记的肽序列标签，分别使用序列比对软件MPsrch、FASTS 和WU-BLAST2 对数据库做同源性搜索，3 种软件都鉴定了4 种新蛋白质，并通过功能研究和序列同源性分析最后确定了一个可以解释其脱氢酶活性的新蛋白.b. 由de novo 测序软件得到序列标签不依赖于实验的处理过程，应用de novo 测序软件直接从常规的串联质谱图中读取肽段序列. 常见de novo 测序软件的典型输出结果是一系列有序、无序的短肽段序列标签，或残基质量标签，利用这些短片段也就组成了序列标签.常用产生肽序列标签的软件见表1. 一般的denovo 测序软件都可以通过网页形式免费访问，能满足大部分实验鉴定的需要，如果需要本地化大批量的对质谱数据进行肽序列标签

的读取可以购买商业版本的软件如Peaks，或者下载免费的代码如Pepnovo 等. 由de novo 测序软件得到的短序列标签将通过数据库搜索算法与理论序列相关联，找到一致或相似的蛋白质序列. BLAST、FASTA、Shotgun[8]是序列同源性搜索最基本的几种算法，最初运用denovo 测序得到的短肽标签进行下一步蛋白质鉴定分析的软件大多是基于它们的改进像MS-BLAST、FASTS/FASTF 和MS-Shotgun，一般都没有考虑de novo 测序的错误. 随后基于FASTA算法改良的CIDentify 考虑了同位素峰和氨基酸质量无法区分的情况. DeNovoID 这个算法依赖于氨基酸序列的组成而对顺序没有要求，所以其用于查询的标签既可以有序也可以无序，还可以包括质量标签. 同源性搜索工具SPIDER 考虑了同源突变和de novo 测序的错误. GutenTag 软件整合了肽序列标签的产生和同源性比较搜库2 分，但没有考虑序列的同源突变和修饰. 主要序列同源性比较软件关于这类方法的应用，早在1994 年，Mann和Wilm[9]就提出了用肽段序列标签鉴定蛋白质的方法. 他们将(碎片质量m1 - 部分序列- 碎片质量m2) 这种形式的肽段序列标签提交给软件PeptideSearch，既可以鉴定数据库中包含的蛋白质，还能鉴定数据库中没有的带有修饰的蛋白质或者可能的新蛋白质. Kim 等[10]在研究一种基因组未测序的土壤细菌时，从Mascot 搜索细菌nr 库没有匹配结果的MS/MS 谱图中手工挑取质量较好的，使用PepSeq 得到部分肽序列，通过与Mascot 结果比较，再经BLAST 同源性搜索得到高可信度的鉴定蛋白质以及一些新蛋白质. Lilla 等[11]也是运用denovo 测序软件PepSeq 和同源性比较程序last-p 鉴定了一个新蛋白质. Kim 等[12]对他们研究中PMF 和PFF 搜索库不能鉴定的结果应用Masslynx 软件经de novo 测序得到部分肽段序列，然后通过NCBI上的Blast 和MS-BLAST 搜索得到接近全长的较精确的匹配结果. Williams 等[13]同样也应用PepSeq 得到序列标签，然后通过MS-Pattern 搜索NCBI 的nr库鉴定蛋白质. 3.2.2 分步、多策略的数据库搜索: 采用ESTs、基因组数据库

De novo 测序不能取代数据库搜索方法在自动化- 高通量蛋白质组学研究中的应用，同样在大规模蛋白质组学研究中进行新蛋白质的鉴定，数据库搜索方法也是不可缺少的. 但因为该方法强烈地依赖于数据库中所包含的蛋白质序列，即使质量很好的谱图，如果数据库中不存在相应的条目也无法得到鉴定结果. 因此，常规的蛋白质数据库不能实现鉴定新蛋白质的目的. 同时，数据库搜索的方法也不能发现序列信息未知的蛋白质，即无法鉴定层次最高的新蛋白质，但是通过分步、多策略的数据库搜索，如采用ESTs、基因组数据库等更广泛全面的数据库，可以鉴定前2 个层次的新蛋白质.大部分蛋白质组学研究在进行基本的蛋白质鉴定的同时也利用实验质谱数据进行补充鉴定和新蛋白质挖掘[14]. 其主要策略就是我们这里提到的分步、多策略的数据库搜索. 早在2001 年，Andersen等就应用二级质谱数据搜索基因组数据库，结合一级谱图分析完善鉴定结果. 这样不但对蛋白质鉴定起到一定的补充作用，并能校正软件预测的基因组ORFs，还能鉴定新蛋白质，文中就用该策略鉴定了一个人的新蛋白质. 2001 年，Creasy 等提出了高通量并且有效的蛋白质鉴定，实验数据应该搜索一系列逐渐增大的数据库：首先，是一个小而质量高的蛋白质数据库如Swiss-Prot 数据库，没有匹配结果的数据再搜索一个全面的EST 数据库，搜索基因组数据库是最后一步. Smith 等在2005 年根据纤毛虫的核酸遗传编码规则，直接将嗜热四膜虫的基因组序列分别按6 个相位翻译成对应的氨基酸序列作为Mascot 搜索的数据库，鉴定了223 个高可信度的蛋白质，然后将鉴定结果与NCBI 的nr数据库进行BLAST 同源性比对，确定了84 个nr库中没有相似蛋白质的结果，认为可能是新蛋白质. 到2006 年，Nesvizhskii 等使用了多种搜索库软件如SEQUEST、Mascot 及X!Tandem，以及不同的参数设置如改变质量误差范围、增加修饰等，以得到尽量多的鉴定结果，并进一步对质谱图按照质量分等级，在基本搜索库没有结果的谱图中挑取质量较好的再搜索基因组数据库进行新蛋白质挖掘. Ying 等也将分步搜索策略应用于人类胎肝蛋白质组学研究的补充鉴定和新蛋白质挖掘中，在进行基本蛋白质鉴定的基础上，应用Q-TOF 数据先后搜索了整合的蛋白质数据库、人类EST 数据库和基因组数据，找到

了更多的蛋白质包括一些新蛋白质. 在数据库搜索策略中采用基因组数据解释质谱数据，并进一步将鉴定结果与基因组综合比较，可以直观地进行转录组和蛋白质组的比较，并实现蛋白质组研究对基因组的补充. Desiere 等[15]利用Ensembl 的分布式注释系统(Distributed AnnotationSystem：DAS)，将SEQUEST 搜库鉴定得到的肽段用BLAST 对应到人类基因组上，并实现可视化.Kalume 等利用质谱数据经Mascot 搜nr 和基因组数据库，再利用DAS 实现可视化把鉴定的肽段匹配回基因组上，并通过实验蛋白质组学的鉴定结果与基因组TBLASTN 比对，确定已知的转录本、新转录本以及一个新基因，并且校正了一些已知转录本. HPPP 在人类血浆蛋白表达谱研究中也对血浆数据进行了新蛋白质鉴定的数据挖掘，他们把人类全基因组按6 种相位开放阅读框翻译成无遗漏的蛋白质数据库作为X!Tandem 软件搜索的数据库，来鉴定血浆蛋白的串联质谱数据，并采用层层严格的质量控制标准来降低假阳性率，将质谱结果匹配到基因组序列中发现了新基因模式，以及可能的新基因编码区和新可变剪接体.综上所述，应用完整的、未经注释的基因组序列来进行蛋白质的鉴定可以极大程度地挖掘质谱数据. 合理安排分步、多策略的数据库搜索，并使用合适的搜索引擎和数据库，可以实现批量、自动化的新蛋白质鉴定，是目前高通量蛋白质组学研究中补充鉴定新蛋白质很好的一种选择.

4. 蛋白质蛋白质相互作用

4.1 蛋白质-蛋白质相互作用的特点生物体内有大量的蛋白质复合物，它们有的由相同的蛋白亚单元组成，有的由不同的蛋白亚单元组成，有些呈永久性结合状态，有些会根据周围环境(如温度、pH 值等)的变化而进行结合和解离。蛋白质复合物虽然在数量上远远超过酶和小分子受体，但它们本身的一些性质和特点却使得很多蛋白质复合物并不适合作为药物的靶标。因此，我们首先需要很好地了解蛋白与蛋白之间的相互作用，这样才能够找到适合与抑制剂结合的蛋白质-蛋白质相互作用界面，进而以其为靶，进行药物研发。1.1 界面的大小 蛋白质与蛋白质结合的界面通常较大。Jones 和Thornton通过对59 个不同的蛋白质复合物进行研究分析发现，同源二聚体相互作用的可溶剂化表面为368Å2 － 4 746Å2，异源复合物的可溶剂化表面为639Å2 － 3 228Å2。Lo Conte 等也提出蛋白质相互作用的平均界面约为1600Å2，包括大约52 个氨基酸残基。理论上，大的结合表面不适合作为药物靶标，这是因为很难找到与之相匹配的分子，即使存在这样的分子，它也会由于吸收、分布、代谢、排泄、毒性(Absorption、Distribution、Metabolism、ExcretionExcretion 、Toxicity，即ADME/T)的性质而被排除在药物的行列之外。然而，“热点区域”(hot spots)[8] 概念的出现却打破了这种观点。热点区域是指对蛋白质复合物的结合自由能贡献比较大的残基。它的面积大约只有600Å2，一般位于蛋白质-蛋白质相互作用界面的中心或其附近， 通常为Trp、Tyr和Arg。Sillerud和Larson[9]运用统计学方法研究比较了蛋白质-蛋白质相互作用界面中残基对其结合自由能的贡献，发现Pro、Ile、Tyr、Trp、Asp 和Arg 对蛋白的结合贡献较大。这一结论与热点区域较为吻合。热点区域的常用表征方法为点突变实验，即将蛋白质-蛋白质相互作用界面上的氨基酸残基突变为丙氨酸，然后，测定其结合自由能的变化，以此来确定对结合自由能贡献比较大的残基。然而，实验的方法耗费的时间和费用通常较大，因此，选用计算的方法来测定热点区域深受人们的青睐。目前，较为流行的计算方法有MM-PBSA (molecularmechanics-Poisson-Boltzmann surface area)中的“基于计算的丙氨酸扫描(computational alanine scanning)”和MM-GBSA (molecular hanics-generalizedBorn surface area)中的自由能分解。这两种方法已被成功地用于热点区域的预测。此外，PASS 软件也可以用来测定蛋白质- 蛋白质相互作用界面上的热点区域。Kortemme 和Baker[16]建立了一个简单计算界面残基突变为丙氨酸时蛋白结合自由能变化的物理模型。因此，蛋白质- 蛋白质相互作用的界面虽然较大，但小分子并不需要覆盖整个作用界面，它只要能够与界面上的热点区域有很好的作用，就可以干扰或抑制蛋白质与蛋白质的结合。一般而言，热点区域较少且相

对集中的蛋白质-蛋白质相互作用界面适合作为研究靶标。1.2 界面的形状 界面的形状是影响小分子结合的一个重要因素。蛋白界面的扭曲程度越大，被掩埋的残基数目就越多，形成的复合物也就越稳定，也就越不利于小分子抑制剂的进入。但是，平整的界面也不利于小分子的结合。因此，应选择具有很好结合口袋且扭曲程度不是很大的界面作为药物设计的靶标。一般而言，异源蛋白复合物的结合界面比同源二聚体的界面平整，永久性蛋白复合物的蛋白质结合界面比非永久性的界面扭曲的程度大。1.3 界面的性质 界面性质的范围比较广，其中互补性和疏水性对蛋白质-蛋白质相互作用界面抑制剂的设计影响较大。互补性是指界面上蛋白与蛋白之间残基的匹配情况。互补性小的界面，结合力较小，较易被小分子抑制。同源二聚体和永久复合物的互补性比较好，而异源复合物和非永久性复合物的互补性相对较差。界面上水分子的多少反映了界面的疏水程度。疏水表面比极性表面更适合药物的结合。一般情况下，蛋白质- 蛋白质相互作用界面包括56% 的非极性基团、29% 的极性基团和15% 的带电基团。永久复合物界面的疏水性强于非永久复合物的疏水性[17]。1.4 蛋白质复合物的结合力 蛋白质与蛋白质主要通过非共价相互作用结合在一起。这些非共价相互作用主要包括静电作用、范德华作用、电荷转移能、氢键作用、芳香残基之间的p-p 以及阳离子p作用等。前面介绍的蛋白质相互作用界面的大小、形状和性质都对蛋白质复合物的结合力有很大的影响。蛋白质复合物的结合力一般较强，同源二聚体的结合常数KD 为10-9 － 10-12 mol/L，非永久性复合物的结合力虽然相对小一些，但结合常数KD 也达到10-6－10-9 mol/L。理论上小分子抑制剂难以破坏很强的相互作用，但在很多情况下，结合平衡的微小变化就足以产生很大的生物学效应，因此抑制剂并不需要完全抑制住蛋白质之间的相互作用。此外，Cochran[18]提出了浓度说。他认为组成蛋白质复合物的两个蛋白质与抑制剂在体内会达到一个平衡，如图2 所示，抑制剂I 与蛋白质P2 竞争性结合蛋白质P1 的能力并不是由它们的相对结合常数决定，而是取决于它们各自的浓度与结合常数的比值。只要抑制剂I 的浓度比蛋白质P2 的浓度高，则具有很强结合力的蛋白质P2 也可能被结合力较弱的小分子抑制剂I 所替代。

4.2 蛋白质-蛋白质相互作用的理论预测方法 前面介绍的蛋白质相互作用特点主要是通过研究已知的蛋白质复合物结构而得到的。然而，蛋白质数据库中的蛋白质复合物结构的数量却是有限的。运用实验的方法来测定蛋白质复合物的结构虽然可行，但需要耗费较大的人力物力，而运用理论的方法来预测蛋白质之间的相互作用是对实验很好的补充，在生命科学研究和创新药物发现中发挥着越来越重要的作用。常见的理论预测方法有基于结构的蛋白质

相互作用预测和基于序列的蛋白质相互作用预测。基于结构的蛋白质相互作用预测，主要是以已经测定出或者模建出三维结构的蛋白质为基础，采用蛋白质- 蛋白质对接的方法，对蛋白质之间的相互作用进行预测研究。此方法不仅可以预测蛋白质是否发生相互作用，而且可以寻找到它们的相互作用界面。常用的蛋白质- 蛋白质对接软件有3D-Dock、ZDOCK[19]、Hex[20]、HADDOCK[21]等。虽然蛋白质的结构可以直接用于蛋白质相互作用的预测，但我们可以获得的蛋白质序列的信息远远超过蛋白质结构的信息。因此基于序列直接对蛋白质-蛋白质相互作用进行预测具有更重要的意义，在这方面，中国科学院上海药物研究所蒋华良研究员最近进行了成功的尝试。他们以支持向量机为基础，结合了新的可交换内核函数和全新蛋白质序列三联子特征提取方法，发展了一种普适化的单纯依赖蛋白序列本身的蛋白质-蛋白质相互作用的预测方法[22]。此预测方法不仅可以预测蛋白质- 蛋白质的相互作用，而且可以预测不同形式的蛋白质相互作用网络。它可以正确地预测超过80% 的蛋白质- 蛋白质相互作用。3 蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂类型蛋白质- 蛋白质相互作用抑制剂的开发比酶和小分子受体抑制剂的开发要困难得多，这一方面是由于蛋白质的结合模式具有多样性；另一方面则在于前面提到的蛋白质相互作用界面本身具有的一些性质和特点。尽管如此，蛋白质- 蛋白质相互作用抑制剂却有着显著的优点。首先，它具有特异性。由于同源家族的酶的催化区域具有保守性，所以抑制剂在体内通常抑制的不仅仅是引起病变的靶标酶，它还会抑制很多同源家族的酶，这就导致很多副作用的产生，而蛋白质复合物的特异性，使得干扰它们相互作用的小分子也具有特异性，所以蛋白质-蛋白质相互作用是一个很有吸引力的药物靶标。其次，它的抗性问题小。酶的催化区域容易发生突变，产生抗药性，而相互作用的蛋白质与蛋白质，若其中一个蛋白亚单元发生突变，则另一个蛋白亚单元只有发生突变，才能与之匹配结合，而两个蛋白同时发生突变的概率很低，因此几乎不需要考虑蛋白质- 蛋白质相互作用的抗药性问题。蛋白质- 蛋白质相互作用抑制剂按其结构可以分为肽、拟肽和小分子抑制剂三种类型。

5. 蛋白质翻译修饰后的鉴定 5.1小麦叶片蛋白质磷酸化

5.1.1 蛋白质磷酸化的主要类型与功能 根据磷酸氨基酸残基的不同，可将磷酸化蛋白质分为4 类，即O－磷酸盐、N－磷酸盐、酰基磷酸盐和S－磷酸盐。O－磷酸盐是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N－磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的； 酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的；而S－磷酸盐则通过半胱氨酸磷酸化形成。蛋白质磷酸化具有以下功能：①磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应中间产物（多为S－或N－磷酸盐），如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统（PTR）中的组氨酸蛋白激酶（HPr）；②磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A（丝氨酸和苏氨酸残基）或不同的受体酪氨酸激酶（酪氨酸残基）；③天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。 5.1.2蛋白分离后磷酸化蛋白的检测

可以通过对磷酸化蛋白的选择性染色或标记检测胶中、膜上及层析柱洗脱组分中的磷酸化蛋白质组。胶／ 膜的染色灵敏度较低，只能检测丰度很高的磷酸化蛋白，但有助于鉴定不同的磷酸化修饰形式（这些不同修饰形式的磷酸化蛋白在凝胶中的迁移形式会略有差别，如形成链状的点等），还可用于检测不同样品之间某些蛋白质是否发生了磷酸化， 以及磷酸化程度明显不同的蛋白。用32P 选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，可以通过纯化激酶及［γ－32P］进行体外标记，或利用［γ－32P］－ATP 或32PO43－（正磷酸盐）平衡胞内的ATP 水平进行体内标记，然后通过SDSPAGE、2D－GE 或薄层层析对蛋白质进行分离， 再经放射自显影或光学成像检测标记的磷酸化蛋白， 单个蛋白点可以从胶上或膜上剪切出

来， 也可以从色谱柱中洗脱时收集放射性标记的蛋白质组分。体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证， 因为在体外情况下激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结论；蛋白质被［γ－32P］－ATP 放射性标记，通常在消化后通过凝胶电泳或薄层层析分离，可以鉴定磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和， 那么不论激酶的活性如何也不会有放射性标记的磷酸基团插入，因此也检测不到磷酸化蛋白；对于经体内32PO43－标记的蛋白质，需要通过双向电泳进行高分辨率的分离。如果蛋白或磷酸化的氨基酸残基可以通过荧光试剂衍生， 那么就可以通过HPLC 结合紫外检测鉴定和定量磷酸化残基。Lees－Miller 等[23]利用放射性32P 对人体内的2 种热激蛋白进行了标记，最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点。de Carvalho 等[24]在昆虫细胞表达了人单核细胞中的细胞质磷脂酶A2， 并采用放射性32P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点。同位素编码亲和标签（ICAT）[25]作为蛋白水平定量的质量标签，已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究。目前，应用磷酸同位素标记亲和标签（PhIAT）已建立了2 种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白／ 肽的方法。Goshe 等[26]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中， 通过β－消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4，形成的双键受到硫代二乙醇的作用，巯基取代磷酸根， 生物素与巯基相连， 这样标记过的蛋白肽即可用色谱分离。Zhou 等[27]用另外一种方法修饰磷酸化肽，用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分， 修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合，酸洗涤释放。此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸，也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸。从20 世纪80 年代起， 人们开始研究蛋白质磷酸化的非放射性分析方法。Meyer 等[28]用ABI470 气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸， 并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH 衍生物。车发云等[29]进一步建立了运用毛细管电泳分析非放射性标记蛋白质或多肽中的各种O－磷酸化氨基酸的方法，在低（pmol）范围同时分析所有3 种PTH－磷酸化氨基酸，进而分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基， 用3 个模型对磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β－酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析， 还以七肽（LRRASLG，肯普肽，Kemptide）为蛋白激酶A 的底物模型[30]，研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件及标记产物的性质， 用荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性。杨琴等[24]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3 在乳腺癌细胞中的分布进行了研究。近年来发展了一些可以对一向或二向分离的凝胶、膜或层析组分中的所有磷酸化蛋白染色的技术。Schulenberg 等[31]报道，荧光染料Pro－Q Diamond dye 可对磷酸化蛋白质特异性染色。Martin 等[32]利用Pro－Q Diamond dye 检验芯片上的蛋白质及多肽的磷酸化水平，灵敏度可达到312～625 fg，将芯片与高灵敏度检出方法结合提供了一个强有力的研究信号通路及磷酸酶抑制物的平台。商品化的Pro－Q Diamond 染色，可以与常用的SYPRO染色剂结合使用。此外，抗磷酸化酪氨酸抗体的Western 印迹检测及荧光素对磷酸基团进行化学修饰标记等技术， 也被用于对磷酸化蛋白的检测中， 尽管抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗体在用于免疫共沉淀时亲和度不足， 但通过免疫杂交分析检测固定于膜上的相应磷酸化蛋白还是绰绰有余的。Seisuke 等[33]利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白后， 用荧光双向差异凝胶电泳（2D－DIGE）技术进行差异分析，大大提高了对磷酸化蛋白的检测力。 6. 定量蛋白质组学的研究技术

6.1 对于小麦叶采用基于凝胶的定量蛋白质组学技术

虽然蛋白质分离技术不断更新, 但是凝胶电泳技术仍是目前最重要的蛋白质分离手段。1D

SDS-PAGE 仍然被作为分离简单蛋白质样品和富集亚细胞蛋白质组分的有效手段。2D蓝色自然胶(blue-native, BN)/S D S - P A G E 也成功地被用于类囊体膜和核复合体蛋白质组的研究。一

年来, 蛋白质提取方法、凝胶电泳和生物质谱等技术体系逐渐完善和优化, 大大提高了对植物蛋白质的解析能力和重现性, 使得一些低分子量的食物过敏原得以检测。一直困扰着植物叶片蛋 白质组研究的高丰度表达的核酮糖-1,5- 二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBisCO)影响低丰度蛋白质分离的问题也被报道可以通过PEG沉淀或应用RuBisCO 免疫耗竭柱(immunodepletion columns))来解决。同时, 人们也找到了消除种子胚乳中富含的淀粉粒和蛋白质体的新方法, 从而可以获得这些组织中的低丰度蛋白。另外, D-DIGE 被广泛应用于植物定量蛋白质组学研究。这种方法将待比较样品分别用不同荧光试剂(cy2, cy3 或cy5)标记, 等量混合后进行双向电泳分离。由于在同一块胶内进行分离, 避免了电泳时操作上的人为误差及胶与胶之间的差异, 可准确地反映出处理样品和对照样品间的差异表达蛋白质。该技术已经被应用于受臭氧胁迫的欧洲山杨( P o p u l u stremula)叶片蛋白质组(、拟南芥突变体油菜素内酯(brassinosteroid, BR)相关调节蛋白, 以及蒺藜苜蓿多根瘤突变体、野生型根响应生长素和苜蓿根瘤菌的蛋白质组研究vanNoorden[34]中。 6.2 小麦胚乳采用基于质谱的定量蛋白质组学技术

稳定同位素体内(in vivo)或体外(in vitro)标记技术也已被广泛应用于植物蛋白质组学的精确定量研究中。常见的体内标记方法包括1 5 N 体内代谢标记和细胞培养中稳定同位素标记氨基酸(stable isotope labelingby amino acids in cell culture, SILAC)方法。SILAC 方法依靠在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸(如赖氨酸或精氨酸等)实现对蛋白质的定量, 已经广泛用于高等动物细胞蛋白质的鉴定及定量。由于植物细胞本身可以合成这些必需氨基酸, 导致只有部分蛋白质被标记, 所以此方法不适合植物蛋白质组学研究。15N 体内代谢标记法采用含有15N (或14N)作为唯一氮源的培养基来培养植物组织(植株),依靠掺入合成蛋白质的15N 实现定量。该技术已经应用于拟南芥培养细胞响应细菌鞭毛蛋白flg22、木聚糖酶,以及镉胁迫的差异表达质膜蛋白质组分析中。此外,Hebeler 等[35]利用该技术与DIGE 和纳升液相串联质谱 (nano-LC-MS/MS)结合, 鉴定了拟南芥叶片衰老过程中包括RuBisCO 大、小亚基和GST 等在内的13 种差异表达蛋白质。常用的体外标记技术主要包括ICAT 和iTRAQ 技术。ICAT 技术是利用一种能和半胱氨酸反应并含有轻链和重链2 种形式稳定同位素的亲和标签试剂, 预先选择性对蛋白质进行标记,然后依次通过胰蛋白酶水解、亲和层析和液相色谱串联质谱实现对蛋白质的分离和定量分析。Hartman等[36]利用ICAT 技术并结合沉降蛋白质复合体检测技术(proteomic complex detection usingsedimentation, ProCoDeS)分析了拟南芥线粒体膜蛋白复合体的蛋白质表达丰度。iTRAQ 技术则是利用4 种(最近已发展为8 种)胺活性试剂组成的一组非多聚体的等质量标记试剂, 对蛋白质酶解的肽段进行差异标记, 再将标记的样本混合, 然后采用MudPIT 进行分析鉴定。Patterson 等[37]利用此技术分析了抗硼和非抗硼大麦的差异表达蛋白质组。 7. 蛋白质生物信息学

7.1 小麦蛋白质磷酸化的生物信息学研究新进展

细胞是生命活动的基本单元. 在分子水平, 细胞生命活动的可塑性与动力学特征体现为动态的蛋白质-蛋白质作用网络. 同一蛋白质的功能因其时空位置而产生不同的生物学意义. 蛋白质的时空动力学特征通常由蛋白质的共价修饰来. 蛋白质磷酸化是细胞内最重要的及常见的一种修饰方式. 在人类细胞中, 参与蛋白质磷酸化的蛋白激酶超过518 个. 通过把三磷酸腺苷(ATP)水解成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根基团, 蛋白激酶能够利用ATP 水解得到的能量将磷酸根基团与底物蛋白质上特定的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基形成共价键, 从而改变其底物蛋白的动力学行为, 并一系列的生物学过程. 每一种激酶通常特异性地磷酸化其底物蛋白质, 从而保证了细胞是生命活动信号转导的精确性. 为此, 鉴定激酶及其底物是阐明细胞生命活动分子动力学系统工程的基础. 由于实验生物学系统鉴定蛋白质磷酸化需要大量的人力与物力资源,中国科技大学姚雪彪实验室开始通过计算生物学的方法进行包括磷酸化在内的蛋白质共价修饰系统预测[1~3].为了预测激酶特异性的磷酸化位点,他们开发了“基于分组打分策略的磷酸化位

点预测平台” (GPS, group-based phosphorylationsite predicting and scoring)的1.0 和1.10 版本[38，39]. 随着计算研究的逐步深入, 发现有两个问题亟待解决: 1) 激酶分类的问题; 2) 预测的假阳性率(falsepositive rate, FPR). 针对以上两个主要的问题, 他们近期对原有的算法进行了较大的改进, 使用JAVA 语言开发了GPS 2.0 软件, 并重新将软件命名为“基于分组打分策略的预测系统”(group-based predictionsystem). 在原有的工作基础上, 假设序列相似并属于同一亚家族的激酶具有相似的催化功能.基于该假设, 将人的激酶谱(kinome)分成组、家族、亚家族和单个激酶. 针对大规模的磷酸化位点预测, 引入了“理论上最大的假阳

性”(theoretically maximal FPR)的概念并成功地预测了~12000 个激酶特异性的磷酸化位点. 同时, 建立了“吻别”(kiss-then-farewell)模型, 即底物的磷酸化修饰需要底物至少与其上游的激酶发生相互作用. 根据这一模型,他们成功地预测了人的Aurora-B 激酶的32 个磷酸化底物.GPS 2.0 能够预测人的408 个激酶特异性的磷酸化位点, 并可通过网站

http://bioinformatics.lcdustc.org/gps2/访问并下载. 可以相信, GPS 2.0 将为激酶特异性磷酸化位点的预测及细胞生命活动分子动力学的研究提供有力的技术支持. 7.2 胚乳蛋白泛素化修饰的生物信息学

泛素(Ubiquitin)是一种由76 个氨基酸构成、在真核生物中广泛存在并具有高度保守性的多肽。泛素化修饰最早被发现的功能是标记靶蛋白, 使之被蛋白酶体识别并降解, 整个过程涉及泛素分子、底物蛋白、多种酶系统( 如泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素结合酶Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素连接酶(Ubiquitin-protein ligase, E3)、去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme, DUB)), 以及蛋白酶体,它们共同构成了泛素-蛋白酶体系统Ubiquitin-proteasomesystem, UPS) 泛素化修饰的细胞活动主要包括细胞周期、细胞凋亡、转录、DNA 损伤修复及免疫应答等[40]。随着泛素化修饰底物蛋白及修饰位点数据的不断产出, 用生物信息学的方法分析这些数据、研究其内在规律已成为研究热点。在修饰位点的研究中,寻找泛素化修饰motif 是一个有意义的方向。翻译后修饰motif 的研究在SUMO 化修饰领域 已取得较好结果。与泛素化修饰相似, SUMO 化同样是一种重要的翻译后修饰, 相比于泛素化, SUMO化已取得更为深入的研究进展。在SUMO 化修饰中,已鉴定到修饰位点处一个一致的核心motif ：ΨKXE[67], 其中Ψ 代表一个氨基酸集合(异亮氨酸I、缬氨酸V、亮氨酸L、丙氨酸A、脯氨酸P 或者蛋氨酸M), K 是SUMO 化修饰位点, X 代表该处可为任意氨基酸, E 代表谷氨酸。值得注意的是, 有些SUMO化修饰位点并不符合以上motif 特征, 符合上述motif 特征的氨基酸残基也并不一定是SUMO 化修饰位点。对于泛素化修饰, 是否存在类似的motif是一个研究热点。 在Gygi 等[68]的研究中, 虽然证实泛素化修饰位点处并不存在motif 特征, 但修饰位点附近的氨基酸表达呈现出一定的趋势, 相对于全部的赖氨酸位点,Gygi 发现泛素化修饰位点处更倾向于呈现出局部净负电荷。在修饰位点左右6 个氨基酸的距离内, 酸性氨基酸如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)表达量增加, 碱性氨基酸如赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)的表达量降低。尽管没有理想的具有预测性的修饰位点附近序列模体, 但是Gygi 发现修饰位点更倾向于集中在偏向N 端一侧精氨酸表达量低、N 端、C 端赖氨酸和组氨酸表达量均较低的位置。虽然Gygi 对泛素化修饰motif 的研究没有非常理想的结果, 然而该方面的尝试不会就此终止, 一方面, 大量泛素化修饰位点还有待于发现, 现阶段数据规模的是泛素化修饰motif 不易被发现的原因之一; 另一方面, 现有寻找motif 的方法也有待于优化提高, 整体水平上泛素化修饰motif 不存在并不表示泛素化修饰motif 不会存在于特定的底物集团之中。新的寻找泛素化修饰motif 的探索还在不断进行之中。

参考文献：

[1] WANG W ，SCAI I M，VIGNANI R，et a1．Protein extraction for two—dimensional electrophoresis from olive leaf，a plant tissue containing high levels of interfering compounds[J~．E Pc r0 ^orPs ，2003，24(14)：2 369—2 375． [2] 赵书宇，刘海英，沈鹏，等.水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析[J].东北农业大学学报, 2012,43(4):62—66. [3，4] 李红兵，康振生.

适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究[A]. 西北植物学报，2011，31(3)：0632—063.

[5] 王中胜, 朱云平, 贺福初. 肽序列从头测序算法. 军事医学科学院院刊, 2006, 30 (5): 465～467Wang Z S, Zhu Y P, He F C. Bulletin of the Academy of MilitaryMedical Sciences, 2006, 30 (5): 465～467

[6] Shevchenko A, Chernushevich I, Ens W, et al. Rapid de novopeptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopiclabeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. RapidCommunications in Mass Spectrometry, 1997, 11 (9): 1015～1024

[7] Matis M, Akelj-Mavri M, Peter-Katalini J. Mass spectrometry anddatabase search in the analysis of proteins from the fungus pleurotusostreatus. Proteomics, 2005, 5 (1): 67～75

[8] Pegg S C, Babbitt P C. Shotgun: getting more from sequencesimilarity searches. Bioinformatics, 1999, 15 (9): 729～740

[9] Mann M, Wilm M. Error-tolerant identification of peptides insequence databases by peptide sequence tags. Analytical Chemistry,1994, 66 (24): 4390～4399

[10] Kim E A, Kim J Y, Kim S J, et al. Proteomic analysis ofacinetobacter lwoffii K24 by 2-D gel electrophoresis and electrospray ionization quadrupole-time of flight mass spectrometry.J Microbiological Methods, 2004, 57 (3): 337～349

[11]Lilla S, Pereira R, Hyslop S, et al. Purification and initialcharacterization of a novel protein with factor Xa activity fromlonomia obliqua caterpillar spicules. J Mass Spectrometry, 2005, 40(3): 405～412

[12]Kim H J, Lee D Y, Lee D H, et al. Strategic proteome analysis ofcandida magnoliae with an unsequenced genome. Proteomics, 2004,4 (11): 3588～3599

[13] Williams T L, Monday S R, Edelson-Mammel S, et al. A top-downproteomics approach for differentiating thermal resistant strains of enterobacter sakazakii. Proteomics, 2005, 5 (16): 4161～4169

[14] Omenn G S, David J, Adamski M, et al. Overview of the hupoplasma proteome project: results from the pilot phase with 35collaborating laboratories and multiple analytical groups, generatinga core dataset of 3020 proteins and a publicly-available database.Proteomics, 2005, 5 (13): 3226～3245

[15] Desiere F, Deutsch E W, Nesvizhskii A I, et al. Integration with thehuman genome of peptide sequences obtained by high-throughputmass spectrometry. Genome Biology, 2004, 6 (1): R9

[16] Kortemme T, Baker D. A simple physical model for bindingenergy hot spots in protein-protein complexes. ProcNatl Acad Sci USA, 2002, 99 (22): 14116-14121

[17] Chene P. Drugs targeting protein-protein interactions. ChemMed Chem, 2006, 1(4): 400-411 [18] Cochran A G. Antagonists of protein-protein interactions.Chem Biol, 2000, 7(4): R85-R94

[19] Chen R, Li L, Weng Z P. ZDOCK: An initial-stage proteindockingalgorithm. Proteins, 2003, 52(1): 80-87 [20] Ritchie D W, Kemp G J. Protein docking using sphericalpolarfouriercorrelations. Proteins, 2000,39(2): 178-194 [21] Dominguez C, Boelens R, Bonvin A M. HADDOCK: Aprotein-protein docking approach based on biochemical orbiophysical information. J Am Chem Soc, 2003, 125(7):1731-1737

[22] Shen J W, Zhang J, Luo X M, et al. Predicting proteinproteininteractions based only on sequences information.Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(11): 4337-4341

[23] Lees－Miller S P, Anderson C W． Two human 90－kDa heat shockproteins are phosphorylated in vivo at conserved serines that arephosphorylated in vitro by casein kinase II[J]． J Biol Chem, 19,2(5):2431－2437． [24] de Carvalho M G, McCormark A L, Olson E, et al． C． Identificationof phosphorylation sites of human 85 －kDa phospholipase A2expressed in insect cells and present in human monocytes[J]． J BiolChem, 1996,271(12):6987

－6997．

[25] Gygi S P, Rist B, GerberSA, et al． Qutitative analysis of complexproteinmixtures using isotope－coded ffinitytags[J]． Nat Biotechnol,1999,17:994－999．

[26] Goshe M B, Conrads T P, Panisko E A, et al． Phosphoprotein isotope－coded affinity tag approach for isolating and quantitatingphosphopeptides in proteome－wide analyses[J]． Anal Chem, 2001,73:2578－2586．

[27] Zhou H, Watts J D, Aebersold R． A systematic approach to theanalysis of protein phosphorylation[J]． Nat Biotechnol, 2001,19:375－378．

[28] Meyer H E, Hoffmann－Posorske E, Donella－Deana A, et al． Sequenceanalysis of phosphotyrosine－containing peptides[J]． MethodsEnzymoh, 1991,201:206－224．

[29] 车发云, 邵晓霞, 徐来根, 等． 毛细管电泳非放射分析蛋白质和多肽磷酸化[J]． 生物化学与生物物理学报, 1997,29(4):3－370．

[30] 车发云, 夏其昌． 磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记[J]． 生物化学与生物物理学报, 2000,32(1):69－73． [31] 杨琴, 陈家童, 耿朝晖, 等． 利用免疫荧光樯记研究磷酸化组蛋白H3 有乳腺癌细胞中的分布[J]． 遗传学报, 002,29(6):471－475．

[32] Schulenberg B, Aggeler R, Beechem J M, et al．Analysis of steadystateprotein phosphorylation in mitochondria using a novel fluorescentphosphosensor dye [J]． J Biol Chem, 2003,278 (29):27251－27255．

[26] Martin K, Steinberg T H, Cooley L A, et al． Quantitative analysisof protein phosphorylation status and protein kinase activity on microarraysusing a novel fluorescent phosphorylation sensor dye [J]．Proteomics, 2003,3(7):1244－1255．

[33] Ueda K, Kosako H, Fukui Y, et al． Proteomic identification ofBcl2－associated athanogene 2 as a novel MAPK－activated proteinkinase 2 substrate[J]． J Biol Chem, 2004,279(40):41815－41821．

[34 ]van Noorden GE, Kerim T, Goffard N, Wiblin R, Pellerone FI,Rolfe BG, Mathesius U (2007). Overlap of proteome changesin Medicago truncatula in response to auxin and Sinorhizobiummeliloti. Plant Physiol 144, 1115-1131. [35]Hebeler R, Oeljeklaus S, Reidegeld KA, Eisenacher M,Stephan C, Sitek B, Stuhler K, Meyer HE, Sturre MJ, ijkwel PP, Warscheid B (2008). Study of early leaf senescencein Arabidopsis thaliana by quantitative proteomics singreciprocal 14N/15N labeling and difference gelelectrophoresis. Mol Cell Proteomics 7, 108-120.

[36]Hartman NT, Sicilia F, Lilley KS, Dupree P (2007). Proteomiccomplex detection using sedimentation. Anal Chem 79, 2078-2083.

[37]Patterson J, Ford K, Cassin A, Natera S, Bacic A (2007).Increased abundance of proteins involved in phytosiderophoreproduction in boron-tolerant barley. Plant Physiol 144, 1612-1631.

[38] Zhou F F, Xue Y, Chen G L, et al. GPS: A novel group-based phosphorylation predicting and scoring method. Biochem Biophys ResCommun, 2004, 325(4): 1443—1448

[39] Xue Y, Zhou F, Zhu M, et al. GPS: A comprehensive www server for phosphorylation sites prediction. Nucleic Acids Res, 2005, 33:184—187

[40] Herrmann J, Lerman LO, Lerman A. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in protein regulation. Circ Res, 2007, 100(9): 1276–1291