・２０・ 江苏预防医学２０１３年５月第２４卷第３期Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊ Ｐｒｅｖ Ｍｅｄ，Ｍａｙ，２０１３，Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．３ ・论：Ｎ－・ 基于胶体△／核酸适体体系筛查肝癌新方法的建立 程晓宏，李海波，史玉坤 江苏省南通市疾病预防控制中心，南通２２６００７ 摘要：目的 探索简单易行的肝癌筛查方法。方法利用分光光度计扫描加入细胞前后胶体金／核酸适体体系光谱，通 加入肝癌细胞较其他细胞Ａ 。／Ａ ：。的变化大，且体系颜色 过比较加人细胞前后Ａ ／Ａｓ ｚｏ变化大小来筛查肝癌细胞。结果由红色变成蓝色。结论基于胶体金／核酸适体体系筛查肝癌方法成本低、简单、准确度较好，建议推广应用。 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—９０７０（２０１３）０３—００２０—０３ 关键词：肝癌；筛查；方法；胶体金／核酸适体 中图分类号：Ｒ一３３１ Ａ ｎｅｗ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒ ＣＨＥＮＧ Ｘｉａｏ—ｈｏｎｅ ，ＬＩ Ｈａｉ—ｂｏ，ＳＨＩ Ｙｕ—ｋｕｎ Ｎａｎｔｏｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｆｏｒｅ— ａｎｄ—ａｆｔｅｒ Ａ６６０／Ａ５２０ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ，ａ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｃａｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ Ａ６６０／Ａ５２０ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍｏｄ— ｉｆｌｅｄ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｃｏｌｏｕｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｃｈａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ｒｅｄ ｔｏ ｂｌｕｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｔ ｗａｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ，ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒ，ｃａｎ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｗｉｄｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｍｅｔｈｏｄ；ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒ 免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生 物医学各领域得到了日益广泛的应用Ｅ 。胶体金是 由氯金酸在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗 耐一定浓度盐的胶体金／ＤＮＡ体系 ］。胶体金能与 肝癌的核酸适体组装成胶体金／肝癌核酸适体体系。 由于肝癌核酸适体与肝癌细胞的特异的分子识别作 用折叠形成特定的三维结构，会使得吸附在胶体金表 粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为 稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金具有独特的光 学性质：分散状态的胶体金呈红色；聚集状态的胶体 金呈蓝色 。 面的核酸适体和胶体金分离，胶体金在没有ＤＮＡ大 分子的保护下，遇盐会被破坏而聚集变成蓝色 ］。基 于此原理，建立了胶体金／核酸适体体系筛查肝癌新 方法。 核酸适体是从ＤＮＡ／ＲＮＡ文库中筛选得到，能够 高亲和性、高特异性地与靶标结合的单链寡核苷酸 （ＤＮＡ或ＲＮＡ）＿４］。与目前在生物医学领域中广泛应 １材料与方法 用的抗体相比，核酸适体是一种全新的分子识别方 法。其具有化学合成简单，适用范围广，组织穿透性 １．１材料试剂：氯金酸（阿拉丁试剂）柠檬酸钠、氯 化钠、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、盐酸（国药集体化学 试剂有限公司）。肝癌的核酸适体 （ＴＬＳ１１：ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＴＣＧ ＣＡＴ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＡＣ 好，有望直接运用于活体分子成像和药物传输，且其 具有免疫原性小、稳定性好等优点。因此，近年来迅 速发展成为在疾病基础研究及诊断治疗中具有广泛 应用前景的新技术。 胶体金具有较大的比表面积，能吸附ＤＮＡ形成 ＧＴＧ ＣＴＧ。北京三博远志生物技术有限责任公司负 责合成和纯化ＤＮＡ）。ＤＮＡ在９５℃水浴加热８ ｍｉｎ Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—９０７０．２０１３．０３．００９ 基金项目：江苏省预防医学科研立项指导项目（ＹＺ２０１００７） 作者简介：程晓宏（１９８３一），男，博士，工程师。研究方向：卫生检验。 江苏预防医学２０１３年５月第２４卷第３期Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊ Ｐｒｅｖ Ｍｅｄ，Ｍａｙ，２０１３，Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．３ ・２１・ 后，用冰迅速冷却后，摇匀，４。Ｃ冰箱保存。肝癌细胞 Ｈｅｐ Ｇ２、肺癌细胞Ａ 。（对照细胞）购于中国科学院典 型培养物保藏委员会细胞库。仪器：Ｔｕ一１９０１紫外 可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；离心机 ＤＬ一５一Ｂ、ＴＧＬ～１６Ｇ（上海安亭科学仪器厂）；恒温 水浴锅（上海精宏实验设备公司）；雷磁ＰＨＳＪ一５（上 海精科）。 １．２ 方法 １．２．１胶体金的合成：所有玻璃器皿均用王水浸泡 处理，洗涤干净。将１ ｍＬ １ ９／６的氯金酸溶液加入 １００ ｍＬＺ．次水，加热至沸，在剧烈搅拌下快速加入 ２．５ ｍＬ １ 柠檬酸钠（Ｏ．２２ ｍ孔径滤膜过滤），沸腾 情况下搅拌３０ ｍｉｎ，离去热源后再搅拌１０ ｍｉｎ，将胶 体金溶液置于棕色瓶中４℃冰箱保存，数月有效，平 均粒径１３ ｎｍ［７３。 １．２．２检测方法：取５００ Ｌ上述合成的胶体金与 １００ Ｌ肝癌核酸适体ＴＬＳ１１搅拌均匀后，室温孵育 ２４ ｈ，７ ０００ ｒｐｍ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，加２００ Ｌ 纯净水使得沉淀溶解得均匀溶液，加入４００ Ｌ ５ ｍＭ ｐＨ ７．５ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ缓冲液震荡摇匀得胶体金／核酸适 体体系。向体系中加入不同浓度、不同细胞孵育， ５ ｍｉｎ后扫描４００—８００ ｎｍ光谱图。通过比较加入细 胞前后Ａ 。。／Ａ 。。变化大小来筛查肝癌细胞。 ２ 结果 ２．１ 吸收光谱对按文献合成的胶体金进行光谱扫 描，最大波长为５２０ ｎｍ（图１曲线１），与文献报道吻 合＿７］。对胶体金／核酸适体体系也进行光谱扫描，最 大波长为５２５ ｎｍ（图１曲线２），红移５ ｎｍ。将胶体 金／核酸适体体系离心后，先加纯净水和缓冲液得均 匀溶液，如图１曲线３所示。其吸光度的下降可能是 胶体金在离心过程中损失造成的。肝癌细胞Ｈｅｐ Ｇ２ 和肺癌细胞Ａ５４９在４００～８００ ｎｍ基本上无吸收（图 １曲线６和曲线７）。加入相近数量的肝癌细胞和肺癌 细胞后，胶体金／肝癌的核酸适体体系对肝癌细胞有 较大的响应（图１曲线５），而对照细胞肺癌基本上无 响应（图１曲线４）。 ２．２ 对肝癌细胞的响应情况 当向胶体金／肝癌核 酸适体体系中滴加肝癌细胞，体系的吸收光谱也呈现 逐渐变化，见图２。胶体金特征波长吸收逐渐下降，表 明肝癌的核酸适体确实能和肝癌细胞结合，胶体金在 没有ＤＮＡ大分子的保护下，遇盐后胶体金会被破坏， 胶体金的状态已经由胶体红色状态变成聚集的蓝色 状态。有文献用Ａ。∞／Ａ 变化大小来表示肝癌细胞 对体系有较好的线性的响应情况ｌ＿７］，见图３。 ｍ） 注：１．胶体金，２．胶体金／核酸适体体系，３．离心后、加细胞前 胶体金／核酸适体体系，４．加入肺癌细胞Ａ５４９，５．加入肝癌 细胞Ｈｅｐ ６２，６．肝癌细胞Ｈｅｐ Ｇ２，７．肺癌细胞Ａ５４９。 图１吸收光谱 注：１．体系加入肝癌细胞前，２．加入５００个细胞；３．加入１ ０００ 个细胞，４．加入２ ０００个细胞，５．加入４ ０００个细胞， ６．加入８ ０００个细胞。 图２胶体金／核酸适体体系加入肝癌 细胞Ｈｅｐ Ｇ２前后吸收光谱 Ｏ．６８ ０．６４ Ｏ．６Ｏ ０．５６ ０．５２ Ｏ．４８ ０ ２ ０００ ４ ０００ ６ ０００ ８ ０００ 图３ 胶体金／核酸适体体系对肝癌细胞的响应情况 ２．３样品测定为了验证建立的新方法，用０．９ 的 生理盐水配置肝癌细胞和肺癌细胞溶液，摇匀后，按 照实验方法，将４ ０００个肝癌细胞和４ ０００个肺癌细 胞加入胶体金／肝癌核酸适体体系来筛查细胞响应情 ・２２・ 江苏预防医学２０１３年５月第２４卷第３期Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊ Ｐｒｅｙ Ｍｅｄ，Ｍａｙ，２０１３，Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．３ 应对肺癌细胞响应较小。／竺譬 系对肝癌细胞有较大的响 参考文献 。。 ，［１］ 王楠，徐淑坤，王文星．纳米金生物探针及其应用［Ｊ］．化学进展， ３讨论 ２００７，１９（３）：４０８—４ｌ３． 肝癌临床诊断方法目前常用的仍主要为基于影 像学检查组织和细胞的形态，其分辨率较低，难以实 现癌症的早期诊断 ］。血清学诊断主要是检测特异 性的肝癌标志物，而特异性检测肝癌功能标志物很少 （主要为甲胎蛋白ＡＦＰ），且不足以阐明各种恶性肿瘤 Ｅ２］杨云，聂立波．纳米金在生物标记分析中的应用进展［Ｊ］．株洲工 学院学报，２００６，２０（４）：１２３—１２７． ［３］刘兴奋，武海萍，李玉兰，等．一种高灵敏度、高特异性检测重金属 Ｈ 的比色生物传感方法［Ｊ］．核技术，２００７，３０（５）：４６７—４７２． ［４］程晓宏 缪进．肝癌早期诊断研究进展ＥＪ］．江苏预防医学，２０ｌ１， ２２（６）：６９—７０． 发生发展的分子机制。肝癌细胞的核酸适体技术是 直接以活的肝癌细胞为靶分子，筛选出来的能和肝癌 细胞特异性结合的核酸适体，而无需了解肝癌细胞的 性质。胶体金／核酸适体体系筛查肝癌细胞的方法是 基于胶体金独特的光学性质和适体分子和靶细胞专 一［５］Ｗｅｉ Ｈ，Ｌｉ ＢＩ，，Ｌｉ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｐｔａｍｅｒ—ｂａｓｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｋｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｅｌｅ ｐｅｏｂｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ，２００７，３７３５—３７３７． ［６］Ｓｈａｎｇｇｕａｎ ＤＨ，Ｍｅｎｇ Ｌ，Ｃａｏ ＺＨ Ｃｈａｒｌｅｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｔａｍｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８，８Ｏ（３）：７２１—７２８． 性的分子识别作用，建立的简单、快速的光度分析 ［７］Ｌｉｕ ＸＪ，Ｃｈｅｎｇ ＸＨ，Ｂｉｎｇ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｖｉｓｕａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｇ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｙｍｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａ ｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ａ ｎａｌ Ｓｃｉ，２０１０，２６：１１６９—１１７２． 方法。目前临床筛查肝癌细胞方法中尚无胶体金／核 酸适体体系筛查法，作为成本低、简单、准确度较好的 方法，对肝癌的筛查、早期诊断具有重要的科学意义 和临床价值，建议推广应用。 ［８］吴华斌，明桓泰，刘爱民，等．江苏省肿瘤高发地区肝癌影响因素 病例对照研究［Ｊ］．江苏预防医学，２０１２，２３（２）：２６—２８． 收稿日期：２０１２—１１一Ｏ２编辑：朱荣 ・论著・ 气相色谱法测定粮食中多种有机磷农药残留方法研究 胡海涛，代澎，郭廓 辽宁省沈阳市疾病预防控制中心，沈阳１１００３１ 摘要：目的研究一种快捷有效的样品处理方法，检测粮食中有机磷类农药残留。方法 采用乙腈超声萃取，萃取液浓 缩后经Ｃ。。柱净化除脂肪，采用ＤＢ－１７０１石英毛细管气相色谱柱、火焰光度检测器进行分离检测。结果 该方法实现了粮食 中１２种常见有机磷类农药检测中的快速净化，加标回收率８３．６ ～１０３ ，精密度３．１ ～８．７ 。各组分检出限均可达到 ０．０１０ ｍｇ／ｋｇ。结论该方法可以快速净化粮食样品中各种杂质，快捷简便，实用性强，适用于粮食中有机磷类农药的检测。 关键词：有机磷；农药残留；气相色谱法；粮食 中图分类号：Ｒ一３３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—９０７０（２０１３）０３—００２２—０３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ｉｎ ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ ｗｉｔｈ Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ＨＵ Ｈａｉ—ｔａｏ ，ＤＡＩ Ｐｅｎｇ，ＧＵＯ Ｋｕｏ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３１，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ，ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ｉｎ ｆｏｏｄ— ｓｔｕｆｆ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ．Ｔｈｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｃ１８ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ，ｔｈｅｎ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＤＢ－１７０１ ｑｕａｒｔｚ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒａｍｅ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅａｌｉｚｅｄ ｔｈｅ ｐｕｒｇｅ ｏｆ １ ２ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ８３．６ 一１０３ ，ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ａｃｃｕｒａｃｙ Ｗａｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ３．１ 一８．７ ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—９０７０．２０１３，０３．０１０ 基金项目：沈阳市科学技术局项目（ＦＩ２—１８３—９—００） 作者简介：胡海涛（１９８０－－），男，本科，主管技师，主要从事卫生理化检验工作。
