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浓香型白酒窖泥营养液配方正交设计优化

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第44卷第4期 酿 酒 V01.44.№.4 2 0 1 7年7月 LIQUOR MAKING July,2017 文章编号:1002—8110(2017)04-0075—05 浓香型白酒窖泥营养液配方正交设计优化 彭 兵,李忠奎,吴攀攀,杨牢记,丁鹏飞,李长润,董宏,汪焰胜,黄训端,张部昌 (安徽大学金种子酒业产业技术研究院,中国合肥230601) 摘要:窖泥营养液是浓香型白酒生产的主要物料之一,在窖泥制备和养护中发挥重要作用。为提高营养液的制 备质量,本研究以己酸菌JZZ和窖泥复合茵液为菌种,以营养液中己酸含量为指标,采用正交设计优化窖泥营 养液的配方。结果表明:添加不同浓度的乙醇、醋酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁条件下,营养液中已酸含量不同,单因 素对营养液质量有影响;正交试验分析提示各因素对营养液的影响程度依次为:乙醇浓度>醋酸钠浓度>磷酸 氢二钾浓度>硫酸镁浓度;最佳培养配方为:酵母膏0.1%,硫酸铵0.05%,乙醇2%,磷酸氢二钾0.15%,硫酸镁 0.005%,醋酸钠0.25%,在此配方下培养,己酸含量达到4.31mg/mL。本研究采用正交设计获得了最佳窖泥营养液 配方,营养液中己酸含量高,为窖泥营养液的进一步应用奠定基础。 关键词:营养液;己酸;正交试验 中图分类号:TS262.3 文献标识码:B Optimization on Formula of Nutrient Soluti0n f0r Luzhou Flavor Pit Mud by Orthogonal Design PENG Bing,LI Zhongkui,WU Pan—pan et al (Insittute of Industry and Technology of Anhui Univemity-Golden Seed Winery,Hefei 230601,China) Abstract:Nutrient solution of pit mud is a main material to produce Luzhou lfavor liquor and plays important role in the preparation and maintenance of pit mud.In order to improve the quality of nutrient solution,caproic acid bacteria jzz and compound microbila strains of pit mud are used to inoculate cultural medium and nutrient solution formula of pit mud optimized by orthogonal design.The results showed that single factor influence on nutriiton quality,such as ethanol,sodium acetate,potsasium hydrogen phosphate,magnesium sulfate,etc.. Through orthogonal test analysis,influence of each factor sorting as follow:ethanol,sodium acetate,potassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate,and optimal culture formula:0.1%yeast extract,0.05%ammonium sulfate,2%ethanol,O.15%potassium hydrogen phosphate,0.005%magnesium sulfate,0.25%sodium acetate.Applying optimal culture formula,the yield of caproic acid in nutrient solution Was 4.3 1mg/mL.This study Obtained hte best nutrient solution formula of pit mud by orthogonal design with high caproic acid content,which lays a ̄undafion for hte further application of nutrient liquid pit mud. Key words:Nutrient solution,Caproic acid,Orthogonal design 窖池是固态法酿造浓香型白酒的基础条件,窖泥 是酿酒生产“窖底香”的源泉。但在长期酿造生产中, }基金项目:金种子人工窖泥快速培养技术研究(Y06099204);安徽大学2016年百门精品实践课程建设项目 收稿日期:2017—03-03 作者简介:彭兵,男,高级工程师,研究生,从事酿造技术研究。 通讯作者:张部昌,男,安徽五河人,博士,教授,从事生物工程研究。 由表8可知待测水样COD浓度在50mg/L 子干扰的基础上,控制消解温度165±2℃,得出消解 ~800mg/L范围内,消解时间为10min时测定结果的 时间为lOmin时,测定水样结果的准确度在98%以上。 准确度已达到98%以上,随消解时间的增加,测定结 10min后随消解时间的增加,测定结果的准确度仍维 果的准确度仍维持在98%以上,因此消解lOmin时即 持在98%以上,因此最佳消解时间为10min。此方法能 可将水样中的还原性物质尽可能的氧化。 快速准确的测出结果,对水污染监控起到一定的作用。 3结论 【参考文献】 本文通过用非密闭催化消解分光光度法测定一系 【1】沈怡方.白酒生产技术全书[M】.北京:中国轻工业出版社,1998. 列的水样(COD值在50mg/L一800mg/L),在消除氯离 【2]水和废水监测分 (4版增补版)嗍.中国环境出版社,210—216. [3】毕惠珍冰质化学需氧量(c0D)的快速测定切.环保科技,201Z1:31—33. 第四期 萌良 酒 2017 老窖泥往往会出现退化现象,其后果是所产白酒“窖 钠均购于生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母粉 底香”不浓或几乎没有香味,给酿造生产带来损失。 窖泥营养液的开发是在窖泥退化及修复实践中 开始的。早期的产品如窖泥营养液(有时也称养护液、 养窖液),主要是能提供一些c、N等营养成分的液体, 有些是化学肥料,有些是酿酒副产物或废弃物,如黄 浆水、底锅水、酒尾、糟渣过滤液等,这些成分添加能 和蛋白胨(英国OXOID公司);厌氧袋和耗氧剂(日本 MGC公司);己酸和内标物2一乙基丁酸为色谱纯(西 亚试剂公司);乙醇和乙醚为分析纯(国药集团);底锅 水(安徽金种子酒业股份有限公司)。 1.1.3菌种活化培养基 EAM培养基:乙醇2%(灭菌后使用前加入),醋 5%,酵母粉0.1%,硫酸镁0.02%,磷酸氢二钾 延缓窖泥的退化,起到养护作用【lJ。随着对微生物的研 酸钠0.究深入,酿酒科技工作者开始向养护液中添加酿造微 生物,如己酸菌、酯化红曲、大曲粉等,逐渐由单纯提 供窖泥营养物质,演变成以扩增功能菌和提供营养等 综合I生功能,也使营养液的使用范围从一般陛窖泥养 护扩展到人工窖泥刚生产等方面。 浓香型白酒的主体香味成分是己酸和乙醇通过 微生物酶作用而产生的己酸乙酯,浓香型窖泥营养液 的己酸含量是反映其质量的重要指标。目前使用最多 的窖泥营养液为己酸菌复合菌液或己酸菌纯种培养 菌液来用于人工窖泥的培养。武汉佳成公司开发的复 合己酸菌液作,成为市场上主要商品化的窖泥营养液 产品。宋河酒厂的技术人员也建起了一套利用多种功 能微生物复配的功能菌系来培养人工窖泥的技术,培 养出来的窖泥在微生物的数量及感官上都要优于普 通窖泥[54。任剑波等进行了复合功能菌液配方研究,但 产物中己酸含量较低 。 上述表明,窖泥营养液在浓香型白酒生产实践 中,不断发展和应用,但所报道的营养液的配方差异 很大I89,],所培养的营养液质量参差不齐,通过配方优 化,才可以培养出稳定、高质量的营养液。本研究在前 期工作中发现酵母膏和硫酸铵在营养液培养中有重 要作用,其适宜添加量分别为0.1%和0.05%,因此,本 实验以酵母膏0.1%,硫酸铵0.05%作为常量,对乙醇、 醋酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁作为变量进行单因素实 验,在此基础上采用正交设 q优化配方组合,筛选出 最适宜的营养液配方,为人工窖泥制备等产业化提供 依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种:己酸菌菌种JZZ,CGMCC No.11948保藏; 窖泥复合菌液,自制。 1.1.2试剂 硫酸铵、磷酸氢二钾、醋酸钠、乙醇、硫酸镁、氯化 濑 0.04%,硫酸铵0.05%,碳酸钙1%,自然pH。 LB培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化钠l%。 1.I.4营养液培养初始培养基 初始培养基:食用酒精2%(灭菌后使用前加入),酵母 膏0.1%,醋酸钠0.25%,硫酸铵0.05%,底锅水10%, 磷酸氢二钾0.05%,硫酸镁0.01%。 1.2方法 1.2.1种子培养 己酸菌JZZ纯种培养:从冷冻甘油管中接种己酸 菌JZZ至装有15mL EAM培养基的15mL离心管,置 于37℃恒温培养箱中密闭培养,培养7d后转接 250ml三角瓶中继续37℃密闭培养一段时间后种子 培养完成。 窖泥复合菌液培养:首先称取1 g优质窖泥加人 LB液体培养基中进行37%富集培养1d后,按5%接 种量转接至250ml EAM液体培养基三角瓶中继续 37℃密闭培养一段时间后种子培养完成。 己酸菌JZZ和窖泥复合菌液均培养至OD6000.6 时,按1:1的接种比例,以总接种量5%加入实验组内。 1.3单因素试验 1.3.1乙醇添加量对营养液己酸含量影响 以三角瓶250mL装液量为基准,在不改变初始 培养基其他组分条件下,高压灭菌,冷却后控制乙醇 浓度分别为0%,2%,4%,6%,8%,再分别加入12.5mL 己酸菌JZz和窖泥复合菌后混匀,37 ̄C密闭培养,取 样检测不同乙醇浓度下己酸含量。 1.3.2醋酸钠添加量对营养液己酸含量影响 以三角瓶250mL装液量为基准,根据不同醋酸 钠添加量,在不改变初始培养基其他组分条件下,使 醋酸钠浓度分别为0%,0.25%,0.5%,0.75%,l%,高压 灭菌,冷却后分别加入5ml乙醇混匀,再分别加入 1 2.5mL己酸菌JZZ和窖泥复合菌液混匀,37℃密闭培 养,取样检测不同醋酸钠浓度下己酸含量。 第四期 彭兵,等:浓香型白酒窖泥营养液配方正交设计优化} 2017 1.3.3硫酸镁添加量对营养液己酸含量影响 1 t-LL;柱温条件:起始温度60 ̄C(1min),以40 ̄C/arin 2.5minI1 。 以三角瓶250mL装液量为基准,根据不同硫酸 升温至120 ̄C,再以16oC/min升温至200℃保持 镁浓度,在不改变初始培养基其他组分条件下,使硫 酸镁浓度分别为0.005%,0.01%,0.02%,0.04%,溶解 后高压灭菌,冷却后分别加入5ml乙醇混匀,再分别 加入12.5mL己酸菌Jzz和窖泥复合菌后混匀,37℃ 2结果与分析 2.1 乙醇对营养液己酸含量的影响 在不改变初始培养基其他组分的条件下,对己酸 密闭培养,取样检测不同硫酸镁浓度下己酸含量。 1.3.4磷酸氢二钾添加量对营养液己酸含量影响 以三角瓶250mL装液量为基准,根据不同磷酸 氢二钾浓度,在不改变初始培养基其他组分条件下, 加入磷酸氢二钾浓度分别为0%,0.15%,0.3%,0.45%, 溶解后高压灭菌,冷却后分别加入5mL乙醇混匀,再 分别加人1 2.5mL己酸菌jzz和窖泥复合菌后混匀, 37℃密闭培养,取样检测不同磷酸氢二钾浓度下己酸 龟. I/ 链1己 4 4 3 3 2 2 15 O 5 O 5 O 5 O 5 O 含量。 1.4正交试验 通过单因素实验结果分析,选取影响该菌系生长 的四个因素进行正交实验设计,通过正交实验获得最 佳培养条件。每个因素取3个水平,采用的四因素三 水平正交实验见表1。 表1 正交试验设计的因素水平 1.5 已酸含量测定方法 样品处理:吸取待检测样品于1.5mL离心管中, 12000r/min离心5min后,过0.22la,m滤膜,吸取 500 L加入5mL容量瓶中,再加入500 L内标液后 使用无水乙醚准确定容至5mL。颠倒混匀容量瓶数次 后,吸取1.5mL上清液于进样瓶中即可进行气相色谱 检测。 内标液的配制:准确称取内标物2一乙基丁酸原 液o.185g于100mL容量瓶中,用体积分数为60%乙 醇水溶液定容至100mL,配制成1.85mg/mL 2一乙基 丁酸内标液待用。 采用GC检测,气相色谱仪:岛津2010;色谱柱: Stabilwax聚乙二醇石英毛细管(30m×0.320mm× 0.25 in);检测器:氢离子火焰检测器;柱流量: 2mL/min;进样口:250 ̄C;检测器260oC;进样量: 含量的影响,结果见图1。 厂、、、. /—\ / \ / \ / \ l 一 } ● 龟. Ⅲ/越爨链1 5 4 3 2 乙醇浓度 图1 添加不同乙醇浓度对营养液中己酸含量影响 在图1中,不同的乙醇浓度添加可见明显的己酸 含量梯度变化,在2%乙醇浓度有较高的己酸含量,之 后随着乙醇浓度增加,营养液中己酸含量逐渐降低, 可能是随着乙醇浓度的增大,抑制营养液中己酸菌的 生长,从而导致己酸含量的降低,说明在此条件下2% 乙醇添力ii为最优的添加比例。 醋酸钠对营养液己酸含量的影响 ■一 //。 -0 —— / U 0.:己5 0.50 U. 75 1.OU 醋酸钠浓度 图2添加不同醋酸钠浓度对营养液中己酸含量影响 由图2可以看出,随着醋酸钠浓度的增加,己酸 含量也在不断的提高,在醋酸钠浓度0.25%时,己酸含 量达到最大值,之后随着醋酸钠浓度的增加,己酸含 量逐步降低,可能是由于醋酸钠是碱性盐,浓度增大 会一定程度影响营养液的pH,从而影响最终的己酸 产量,可见在此条件下,醋酸钠浓度0.25%为最佳的添 加浓度。 2.3磷酸氢二钾对营养液己酸含量的影响 在不改变初始培养基其他组分的条件下,测定不 同磷酸氢二钾添加量对己酸含量的影响,结果见图3。 己 1 0  1 0第四期 4.5 g 4.0 雨良 酒 2017 性,测得营养液中三次平均己酸含量为4.31± ● 一— ’ -● —警3.5 0.037mg/mL,试验结果可靠,具有可重复性。 ’ 表2营养液配方正交试验设计结果 试验号 A B C D 己酸含量/mg・mL-’ 1.0 O.5 0 0.02 0.04 硫酸镁浓度 图4添加不同硫酸镁浓度对营养液中己酸含量影响 由图3可以看出,随着磷酸氢二钾浓度的增加, 营养液中己酸含量逐步增大,当磷酸氢二钾浓度达到 0.3%时,己酸含量达到最大值,随着磷酸氢二钾浓度 的进一步增加,己酸含量开始降低,可能是因为磷酸 氢二钾浓度增加一定程度影响了营养液的pH,从而 影响了己酸的产量,说明在此条件下,磷酸氢二钾浓 度0.3%为最合适的添加浓度。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2.4硫酸镁对营养液己酸含量的影响 在不改变初始培养基其他组分的条件下,测定不 同硫酸镁添加量对己酸含量的影响,取样进行GC分 2 2 2 3 3 3 7 舳D 析检测营养液己酸含量,结果见图4。 。2 3 2 3 2 3 7 0 4 /2 3 2 3  ’—、3 2 :8 s 3 3 .rr 錾2 ●2 3 3●2 2 3, 衄l 7 3 0 0 0-30 0.45 磷酸氢二钾浓度,% 图3添加不同磷酸氢二钾浓度对营养液中己酸含量影响 n 3 4 3 l 2 9 8 6 2 1 9 6 8 6 6 1 9 3 由图4可知,随着硫酸镁浓度的增加,营养液中 己酸含量不断升高,当硫酸镁浓度为0.01%时,营养 液己酸含量达到最大值,之后随着浓度的进一步增 大,己酸含量开始降低,说明在此条件下的最适硫酸 镁添加浓度为0.01%。 2.5正交试验 由表2的极差分析可知,影响己酸含量的因素主 次顺序依次为A>D>B>C,即乙醇浓度>醋酸钠浓 度>磷酸氢二钾浓度>硫酸镁浓度。由表2的直观分 析可知,窖泥营养液最佳配方为A:B。c D ,即乙醇终浓 度2%,磷酸氢二钾浓度0.15%,硫酸镁浓度0.005%, 醋酸钠浓度0.25%,在此条件下,己酸含量最高。 按最佳组合进行平行实验,验证最优配方的可靠 R 3讨论与结论 窖泥营养液是窖泥的配套性产品,对窖泥保养起 3 到重要的辅助作用,许多酒企都重视窖泥营养液的制 备和运用 ,并根据生产实际,研究开发了多种形式的 7勰 营养配方。本研究以实验室筛选的纯种己酸菌J ZZ和 窖泥混合菌为研究菌株,以初始培养基为基础进行营 n " 养液配方的单因素实验,6 结果发现乙醇、醋酸钠、磷酸 氢二钾及硫酸镁的不同添加浓度对最终营养液己酸 6 犍 含量影响较大,正交试验直观分析结果表明影响营养 液中己酸含量主次因素中最重要的是乙醇浓度,这表 明乙醇在营养液己酸含量中影响至关重要。通过正交 试验获得的最佳配方为:乙醇2%、磷酸氢二钾0.15%、 硫酸镁0.005%、醋酸钠0.25%,同时结合初始培养基 和单因素实验结果得到最佳营养液配方为:酵母膏 O.1%、硫酸铵0.05%、乙醇2%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸 镁0,005%、醋酸钠0.25%。 本研究采用的优质窖泥混合菌,协同添加的纯种 己酸菌JZz,利用微生物之间共栖『生来协同提高己酸 菌的发酵能力,解决了单株己酸菌产酸能力有限的问 题,同时,优质窖泥混合菌的添加富集了营养液中的 功能微生物,使得在人工窖泥培养中功能微生物成为 优势菌株,避免杂菌的滋生影响人工窖泥的品质[13-151, 因此采用窖泥混合菌的菌种复配值得各大浓香型酒 厂推广应用。正交试验设计具备了“均匀分散,齐整可 比”的特点,是一种高效率、快速、经济的实验设计方 卯 7 7 钉7 3 第44卷第4期 酿 酒 V01.4_4.No.4 2 0 1 7年7月 LIQUOR MAKING July,2017 文章编号:1002—8110(2017)04—0079—03 白酒工业废水中色度对总磷测定影响的探讨 马侠,张良东,王录 (安徽古井贡酒股份有限公司,安徽毫州236820) 摘要:水质总磷的测定钼酸铵分光光度法GB 11893-89中介绍,如试样含有浊度或色度时,需配制空白试样, 然后向试料中加入3mL浊度一色度补偿液,然后从试料中吸光度扣除空白试料的吸光度。白酒工业废水中往往 含有一定色度,因此,在样品测定时需进行色度补偿校正。通过对白酒工业废水在进行与不进行色度补偿时总磷 测定结果的比较分析,可知,在色度约为200度(铂钴比色法)以下的样品如不进行色度补偿对总磷测定结果的 影响可以忽略不计。 关键词:总磷;钼酸铵分光光度法;白酒工业废水;色度补偿 中图分类号:TS262.3;TS207.3 文献标识码:B 磷是生物生长必须的元素之一,但水体中磷含量 仍含有一定色度值。在试验中,除了对选取的有代表陛 过高,可造成藻类的过度繁殖,直至富营养化,造成湖 的样品进行零浓度空白校正外,还有必要对样品本身 泊、河流透明度降低,水质变坏。因此,对水体中总磷 的色度进行补偿校正(也叫样品空白校正)。通过研究 的测定非常有必要。在实际测定中为了保证测定结果 具有代表性的色度较大的样品(约为200度)以及色 的准确性,需要排除影响测定的干扰因素,比如色度、 度居多的样品(约为40度),分析在进行与不进行色 浊度等。白酒工业废水中间过程样品中通常会含有一 度补偿时对总磷测定结果的影响。 定的色度,在测定之前需判断样品色度对测定结果的 色度采用水质色度的测定一铂钴比色法GB 影响大小,从而得出结论,采取必要措施加以控制,保 1 1903—89,用氯铂酸钾与氯化钻配成标准系列,与样 证结果的准确性,提高工作效率。 品进行目视比色。 在测定水中总磷,虽通过预处理,但消解后,样品 1材料和方法 收稿日期:2017—03—28 作者简介:马侠(1992一),女,安徽亳州人,本科,食品科学与工程专业,助理工程师,从事白酒酿酒副产物分析工作。 法,因此本研究利用正交试验设计陕速的获得了最佳 Ⅱl酿酒科技2003(1):96. 窖泥营养液配方,营养液中己酸含量高,下一步工作 【7】任剑波,姚万春,唐玉明,等.窖泥复合功能菌液培养配方研究叨.酿酒, 可结合生产实际进行窖泥营养液的大规模培养,进行 201 .47—5n [8]彭文明,周敬敏 娟.己酸菌复合菌液在浓香型白酒生产中的应用叨. 人工窖泥的培养或窖泥的养护工作,提高浓香型白酒 中小企业管理与 ̄,2014(20):311-312. 生产效益。 [9]高爽,马荣山,任静,等.己酸菌发酵液在浓香型大曲酒生产中的应用叨. 【参考文献】 酿酒2006(3):34—37. [11尹冉民口子复合营养液在窖池中的应用啪.酿酒,2009(6):40—41. 【1 开泰.正交与均匀试验设计n幻一E京科学出版社2001. [2】姚万春,唐玉明,f壬道群等.功能性人工窖泥培养配方筛选叨.中国酿造, [1 1】彭兵,祝熙,李忠奎,等.窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的 2014(8) ̄3—66. 研究呻.中国酿造2016,35圆:43—46. f3降海峰,沈才洪,卢中明,等.不同配方人工窖泥的培养研究叨.酿酒科技, [12]徐军.人工窖泥培养中功能菌发酵液的制备叨.酿酒科技201 1(1 0): 201 1(12):56-61. 31-32. [4】谢国排,程伟,汪焰胜,等.金种子浓香型白酒人工窖泥培养工艺分析与 【13解己酸菌沼撒香型白沼.舻中的应用口】廊 骄 技2O12(1 7—79. 探讨叨.酿酒,2015,42(5):49—55. 【14】姚继承,张宗奇.影响己酸菌生长代谢的因素田.酿酒科技2OO8(2): [5】岳小青刘志成扬志龙,等.复合己酸菌液的培养及其应用研究叨.中小 82-85. 企业管理与 ̄,2012(18):315—316. [151曹新志,黄春萍,熊俐,等.共培养对己酸菌生长代谢影响的初步研究 【6肠红文,马玉磊.已酸菌液、窖泥营养液在浓香型大曲酒生产中的应用 阴.中国酿造2010(1 1):35—38. 

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