制药工艺学

制药工艺学

第一章 绪论

制药工艺学是研究药的工业生产过程的共性规律及其应用的一门学科，摆阔制备原理、工艺路线和质量控制。

制药工艺的研究可分为小试、中试及工业化生产三个步骤，分别在实验室、中试车间和生产车间进行。

1小试研究 在实验室规模的条件下，研究化学或生物合成反应步骤及其规律、工艺参数与原料，并估算成本。对于工艺路线研究，可选择的策略有天然原料的直接分离提取、全化学合成、半合成、微生物发酵、动植物细胞培养，甚至是动植物的养殖与种植，很大程度上基于经济可行性的考虑。工艺研究还包括各反应步骤相关的分离纯化技术及其单元组合对收率的影响。同时，研究建立成品、半成品、中间品、中间品、原料的检验分析与质量控制方法。最终设计出合理的工艺路线，确定出收率稳定、质量可靠的操作条件，为中试放大的研究提供技术资料。

2中试研究 在中试车间的条件下，进行工艺试验与工业化生产的考查和优化。研究放大方法及其影响因素，确定最佳操作条件。进行物料衡算、能量衡算，对工艺进行经济性评价。取得工业生产所需的资料和数据，为工程设计和工业化生产奠定基础。

3工业化生产工艺研究 基于中试研究的结果，制定出生产工艺规程，在生产车间进行试生产。对工艺进行验证，在各项指标达到预期要求后进行正式生产。

按照制造技术可分化学合成药物、生物合成药物、和中药三大类。

把制药工艺过程分为4类：化学制药工艺、生物技术制药工艺、中药制药工艺和制剂工艺。

第二章

一种化学药物可通过若干种不同的途径获得，通常将具有工业生产价值的合成途径称为该药物的生产工艺路线。

化学药物的设计方法与有机合成设计方法有许多类似之处，诸如类型反应法、分子对称法、追溯求源法和模拟类推法等。

类型反应法是指利用常见的典型的有机化学反应与合成方法进行合成工艺路线设计的方法。【抗真菌药物克霉唑的拆分】

具有分子对称性的药物往往可由两个相同的分子片段经化学合成反应制得，或在同一步反应中将分子的相同部分同时构建起来，这就是分子对称法。

从药物分子的化学结构出发，将其化学合成过程一步一步逆向推导，进行寻源的思考方法称为追溯求源法。

理想的药物合成工艺路线应该是：1、化学合成途径简捷，即原辅材料转化为药物的路线要简短；2、所需的原辅材料品种少且易得，并有足够数量的供应；3、中间体容易提纯，质量符合要求，最好是多步反应连续操作；4、反应在易于控制的条件下进行，如安全、无毒；5、设备条件要求不苛刻；6、“三废”少且易于治理；7、操作简便，经分离、纯化易

达到药用标准；8、收率最佳、成本最低、经济效益最好。

理想的药物合成工艺路线应具备合成步骤少，操作简便，设备要求低，各步收率较高等特点。合成路线有“直线方式”和“汇聚方式”两种装配方式。

反应类型有“平顶型”和“尖顶型”两种。工业生产中通常倾向于采用“汇聚方式”。

第三章

多个化学单元反应合成并成一个合成工序的生产工艺，习称“一勺烩”工艺。

反应条件和影响因素等可以概括为7个方面，这也是化学合成药物工艺研究的7个主要课题。

1配料比 参与反应的各物料之间物质量得比例称为配料比（也称投料比）。

2溶剂 溶剂主要作为化学反应的介质，反应溶剂性质和用量直接影响反应物的浓度、溶剂化作用、加料次序、反应温度和反应压力的等。

3温度和压力 化学反应伴随有能量的转换，在化学合成药物工艺研究中要注意考察反应温度和压力的变化，选择合适的搅拌器和搅拌速度。

4催化剂 利用催化剂来加速化学反应、缩短生产周期、提高产品的纯度和收率。

5反应时间及其监控 反应物在一定条件下通过化学反应转变成产物，与化学反应时间有关。有效地控制反应终点，力图以高收率获得高纯度的产物。

6后处理 由于药物合成反应常伴随着副反应，因此反应完成后，需要从副产物和未反应的原辅料材料及溶剂中分离出主产物。

7产品的纯化和检验 为了保证产品质量，所有中间体都必须有一定的质量标准，最终产品必须符合国家规定的药品标准。

凡反应物分子在碰撞中一步转化为生成物分子的反应称为基元反应。

单分子反应 在基元反应过程中，若只有一分子参与反应，则称为单分子反应。

有哪些方法可以让可逆反应向需要的方向进行？

平行反应，又称竞争性反应，即反应物同时进行几种不同的化学反应。

相转移催化剂（PTC）是使一种反应物由一相转移到另一相中参加反应的物质，它促使一个可溶于有机溶剂的底物和一个不溶于此溶剂的离子型试剂两者之间发生反应。

第四章

化学拆分的原理：用手性试剂（拆解剂）通过化学反应的方法将外消旋体中的两种对映体转变成非对映异构体，然后利用非对映异构体之间的物理和化学性质的差异将它们分开，得到单一的非对映异构体后在转化成原来的手性化合物。

第十章

根据微生物的代谢产物类型，可把发酵分为初级代谢产物发酵和次级代谢产物发酵，

前者应用于生产氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸等，而后者应用于生产抗生素等产品。从供氧的角度，把发酵分为好氧发酵和厌氧发酵。

发酵制药的基本过程是在人工控制的优化条件下，利用制药微生物的生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后，从发酵液中提取分离、纯化精制，获得产品。菌株选育、发酵、和分离纯化或提炼是发酵制药的三个主要工段。

1生产菌种选育与保存阶段 采用各种选育技术，获得高产、性能稳定、容易培养的优良菌种，并进行有效地妥善保藏，为生产提供源泉。

2发酵阶段 发酵阶段包括生产菌活化、种子制备、发酵培养，是生物加工工程过程保藏的菌种需要活化，扩大繁殖，制备各级种子。发酵是有一定周期的，期间要取样分析，做无菌检查和产量测定。人为加入消泡剂、控制pH，补加碳源、氮源和前体等是常用的促进产量的措施。

3分离纯化阶段 分离纯化阶段包括发酵液预处理与过滤、分离提取、精制、成品检验、包装、出厂检验，是生物分离工程过程。吸附、沉淀、溶剂萃取、离子交换等是常用的提取技术，把药物从滤液中提取出来。粗制品进一步提纯并制成产品就是精制。

成品检验包括性状及鉴别试验、热原试验、无菌试验、酸碱度试验、效价测定、水分测定等。合格品进行包装，为原料药。

从微生物生长、能源利用和产物生成速度的变化及其之间的动力学关系出发可把生长与产物的关系分为：生长与生产偶联型、生长与生产半偶联型、生长与生产非偶联型三类。

新药生产菌的选育

1 自然分离 （1）样品的采集与处理 从自然环境中采集样品，根据分离目的和微生物的特性预处理。（2）分离方法 选择适宜的培养基，满足微生物营养需要和pH条件，添加抑制剂，有利于目标微生物的富集。分离方法有稀释法和滤膜法。（3）活性测定 以非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。用HLPC、LC-MS等，分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术可以结合使用。

2 自然选育 在发酵生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，称为自然选育。其常用方法是单菌落分离，需要反复筛选，确定生产能力比原来菌株高的菌种。基本过程如下：

菌种——单孢子或单细胞悬液——适当稀释——琼脂平板分离——挑单个菌落进行生产能力测定——选出优良菌株。

3 诱变育种 诱变育种是人为创造条件，使菌种发生变异，从中筛选优良个体，淘汰劣质个体，是当前菌种选育的主要方法。其特点是速度快、收效大、方法相对简单，但缺乏定向性。（1）诱变剂 诱发突变的因素有物理、化学和生物三类。物理因素包括各种射线，紫外线、快中子、X射线、激光等。（2）诱变育种方案的设计 诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是多轮重复。首先制定诱变方案，进行诱变实验。其次，确定筛选目标和方案，进行筛选。筛选应该施加一定的选择压力或生理作用，有针对的进行。

前体是加入到发酵培养基中的某些化合物，能直接参与产物的产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身结构并没有发生多大的变化。

种子培养基是供孢子发芽和菌体生长繁殖，包括摇瓶和一级、二级种子罐培养基，为液体培养基。

发酵培养基是提供微生物进行目标产物的发酵生产，不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体大量合成目标产物，是发酵中最关键和最重要的培养基。

补料培养基是发酵过程中添加的培养基。作用是稳定工艺条件，有利于微生物的生长和代谢，延长发酵周期，提高目标产物产率。

分批灭菌操作的灭菌过程 分批灭菌时间包括加热升温、保温和降温冷却三个阶段。灭菌主要在保温阶段实现，但100℃以上加热升温和冷却降温阶段也有一定灭菌贡献。每个阶段的贡献大小，取决于升温和降温时间，时间越长，贡献越大。

空气过滤灭菌的工艺流程

为了获得无菌空气，一般采用三个主要工段。

1 提高空气的洁净度 通过提高空气吸入口的位置和加强过滤。前过滤器可减少压缩机活塞和气缸的磨损，减少介质负荷。

2 除去空气中的油和水 空气经过压缩机不能直接进入过滤器，必需冷却。一般采用分级冷却，油和水凝结成油滴和水滴，在冷却罐内沉降大液滴。旋风分离器分离5微米以上的液滴，丝网除沫器分离5微米以下的液滴。

3获得无菌空气 经过总过滤器和分过滤器灭菌后，得到符合要求的无菌空气，通入发酵罐。

种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，种子罐级数取决于菌种的生长特性和菌体繁殖速度及发酵罐的体积。

通过一级种子罐扩大培养，再接入发酵罐，为二级培养。适合于生长较快的菌种。

通过二级种子罐扩大培养，再接入发酵罐，为三级培养。适合于生长较慢的菌种。

通过三级种子罐扩大培养，再接入发酵罐，为四级培养。适合于生长更慢的菌种。

发酵罐的操作方式有分批式操作、流加式操作、半连续式操作和连续式操作。

发酵过程检测的参数分为物理参数、化学参数和生物参数三类。化学参数包括pH、氧化还原电位、溶解氧、CO2溶解度，尾气成分、基质、前体、产物等浓度。

杂菌检测与污染控制

杂菌检测的主要方法为显微镜检测法和平板划线检测两种。发酵污染杂菌的原因复杂，主要有种子污染、设备及其附件渗漏、培养基灭菌不彻底、空气带菌、技术管理不善等方面。

1 无菌试验方法与污染的判断 可采用肉汤培养法和斜面培养法进行无菌试验。连续三个不同时间的无菌样品，在酚红肉汤培养基上发生颜色变化，或连续三个时间样品在双碟培养基上长出杂菌，即判断染菌。

2噬菌体的检测与污染控制 感染噬菌体后，必然引起菌体生长缓慢，基质消耗减少，产物合成停止。菌体在短时间内大量自溶，浓度下降，溶氧浓度回升、pH逐渐上升、出现

大量泡沫等。对于溶原噬菌体可用双平板法检测确认。对生产进行消毒，定期对生产区环境进行化学消毒处理，改善环境卫生，提高并保持生产区得洁净度；对废气、逃液、剩余样品等存在活菌体的物料，进行处理，严禁排放活体菌等措施都有助于减轻噬菌体污染。

3培养基灭菌不彻底及其控制 培养基灭菌不彻底是常见的倒置发酵过程被杂菌污染的原因。一方面，是由于蒸汽压力或用量不足、灭菌时间不够引起的。另一方卖弄，由于设备制作或安装不当，蒸汽不能到达，造成灭菌死角。培养基灭菌不彻底，杂菌污染会在发酵的前期表现出来，杂菌主要为耐高温的芽孢菌。保证灭菌所需的蒸汽压力、用量和时间；升温不宜太快；含糖和含氮培养基可分开灭菌，进气阀和排气阀开启要缓慢等措施可减少灭菌不彻底。

4空气带菌及其控制 空气过滤器效能下降，灭菌失败，导致通入带菌空气。通过定其检查管件、更换过滤介质和加强检修来解决。

5设备及其附件渗漏引起的污染及其控制 对于设备失修、渗漏引起的杂菌污染，要建立并执行完善的管理制度、操作制度与规程，加强技术设备管理，定期检修和维护发酵设备及各个环节，杜绝杂菌污染。

补料是间歇或连续补加一种或多种成分的新鲜培养基的操作过程。

放料是发酵到一定时间，放出一部分培养物，又称带放，不超过总体积的百分之十。

发酵终点是结束发酵的时间。

第十一章

抗生素的工业化生产有3条途径。第1条途径是微生物发酵生产工艺，即生物合成途径。第2条途径是化学全合成生产工艺，结构相对简单的抗生素可采用此途径，第3条途径是半合成生产工艺，利用化学方法修饰改良生物合成的抗生素，扩大抗菌谱、提高疗效和降低毒副作用等，获得新抗生素。

微生物合成抗生素包括上游的发酵和下游提取两部分。

生产青霉素的菌株是产黄青霉菌株。

青霉素工业大规模发酵生产采用二级种子培养，属于三级发酵。生产一般流程包括孢子制备、种子制备、发酵培养、提取和精制。

青霉素的分离纯化工艺

1预处理与过滤 目的在于浓缩青霉素，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，便于后续的分离纯化过程。滤液澄清透明，可以进行萃取。

2萃取 青霉素采用溶剂萃取法，其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。选择对青霉素分配系数很高的有机溶剂很重要，工业上通常采用乙酸丁酯和乙酸戊酯，萃取2-3次。为减少青霉素讲解，整个过程应在低温下（10℃以下）进行，萃取罐用冷冻盐水冷却。

3脱色 萃取液中添加活性碳，出去色素、热原，过滤出去活性炭。

4结晶 萃取液一般通过结晶提纯青霉素。青霉素钾盐在乙酸丁酯中溶解度很小，在2次乙酸丁酯萃取液中加入乙酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。然后采用共沸蒸馏结

晶，进一步提高纯度。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素盐。

第十四章

目前只有大肠杆菌和酵母系统被用于生产蛋白质药物。

筛选鉴定

在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与重组DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，由于重组率和转化率很低，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（含有载体或重组分子的转化细胞）与非转化子（物载体或重组分子的宿主细胞）、重组子（含有重组DNA分子的转化细胞）与非重组子（仅含有空载体分子的转化细胞），以及期望重组子（只含有目标基因的重组子）与非期望重组子（不含有目标基因的重组子）。单菌落的初步鉴定可采用蓝白斑筛选、菌落杂交、菌落PCR等高通量筛选方法。

工程菌的遗传稳定性筛选P213

第十五章

目前生产人白干扰素的方法

1 人白细胞诱生的人白干扰素

2 Namalwa细胞诱生的干扰素-α

3 基因工程重组人干扰素

4 动物无限系统培养生产工艺

5 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺 其宿主细胞我腐生型假单胞杆菌

工作菌种库的建立及保存

1 培养基制备 生产过程中使用的培养基均按一定工艺要要求配制。

2 接种、转移及培养 取12支工作菌种库或主菌种库菌种接入摇瓶，摇床培养。吸光值（OD值）达5.5±1.0，将摇瓶种子液转移制种子罐中，通入无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心15分钟，加新鲜菌种培养基，将菌成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到百分之十八。

3 保存 分装完毕，于-20℃放置16-20小时，在-70℃下可保存3年。

第十七章

转染是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化（生物法）。

化学转染原理是磷酸钙、二乙胺乙基（DEAE）-葡聚糖和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。

脂质体转染操作 细胞制备：以105浓度铺培养皿或培养板，与5%-7%CO2在37℃培养18-20小时收集CHO细胞。

脂质备：将DNA和脂质体混合均匀，在室温下温育10分钟。

转染与培养：用含有DNA和脂质体的培养基更换原培养基，继续培养6-16小时。吸弃培养基，加入含有DMSO的培养基，轻轻摇晃。培养数分钟，迅速吸弃培养基。用无血清培养基洗涤两次。加入含有丁酸钠的血清培养基，培养20-24小时。吸弃培养基，加入血清培养基，继续培养。

原代细胞、传代细胞、贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞（名词解释）

动物细胞的大规模培养技术

1单层贴壁培养 是指把细胞贴附于一定的固体支持表面上，生长形成单层细胞的培养方法，适合于贴壁依赖性细胞培养。生长的基本过程是，细胞经过吸附、接触而贴附与生长基质表面，然后精心生长、繁殖，很快进入对数期，最后长满整个表面，形成致密的单层细胞。

2 悬浮培养 是指细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程，主要对于非贴壁依赖性细胞。常用的反应器有通气式搅拌和气升式生物反应器。优点是操作简单，培养条件相对单一，容易放大培养。但细胞体积小，密度低。

3 微囊培养 把动物细胞包埋在微囊或微载体内固定化后，进行悬浮培养，适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养。具有密度高、提高了抗剪切力和抗污染力等优点，是生产首选方法。

4 微载体培养 微载体是三维培养系统，有很大的比表面积，细胞贴附于微载体上增殖，

再悬浮于培养液中，具有贴壁和悬浮培养的双重优点。悬浮微球使细胞生长的环境均一，能很好检测和控制。培养基利用率高，重复性好，减小了劳动强度，容易放大。

灌流操作是一种细胞被截留在反应器内的连续操作方式。细胞接种后进行培养，在培养后期不断补加新培养基，同时以同样流量排出部分条件培养基，借助出口的过滤介质分离或重力沉降作用把细胞滞留在反应器中。其优越性在于：①大大提高了细胞生长密度；②通过调节灌流速度，把培养过程控制在稳定、低废物水平，并补充营养物质，细胞生长良好，大大延长了培养周期；③可及时收获产物，避免了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变化，有利于下游纯化；④灌流操作是中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物反应器等的唯一可靠操作方式。但要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于滤过器容易堵塞，从而培养次数。

第十八章

中国仓鼠细胞（CHO）种子细胞制备

1 复苏 冻存的细胞系取出后，置37℃水浴中。化冻后，无菌离心，弃去冻存液。

2 培养 加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清），在37℃、CO2培养箱中培养，连续传三代。

3 消化细胞 将贴壁细胞用酶消化，制成细胞浓度约为2.5×106个／mL，用于接种。

重组人红细胞生成素的纯化工艺

1用活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。

2 用0-1mol/LNaCl-Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。

3 上10%乙腈平衡的RP-HLPC柱（C4填料），用10%-70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。

4 上凝胶柱（预先用20mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），用20mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰，为红细胞生成素。

第二十一章

反应器是用来进行化学或生物反应的装置，是一个能为反应提供适宜的反应条件，以实现将原料转化为特定产品的设配。

对于连续反应器，有两种理想的流动模型：全混流反应器和平推流反应器。

通气发酵罐的主要组成部分有壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统。优点：使用性能好、适用性强，从小型到中型直至大型的微生物培养过程都可使用；pH值及温度易于控制；工业放大方法研究比较多，易放大；适合连续培养。

机械搅拌系统由电机、变速箱、搅拌轴、搅拌桨、轴封和挡板组成。搅拌桨分为径向流搅拌桨和轴向流搅拌浆。

通气搅拌罐的装液量一般不能超过容器容积的70%-80%。

第二十三章

中试放大就是把实验室小试研究确定的工艺路线与条件，在中试工厂（车间）进行的试验研究。放大系数=中试车间的量（如mL）÷实验室的量【单位必须统一】

空时得率相等是指不同反应规模，单位时间、单位体积反应器所生产的产品量（或处理的原料量）是相同的。

清洁生产是指将整体预防的环境战略持续应用于生产过程的产品中，以期减少对人类和环境的风险。