实验2 实验室环境和人体表面的微生物检查
13生物基地 刘洋 201300140059
一、 实验目的
1. 证实实验室环境与人体表面存在微生物 2. 体会无菌操作的重要性
3. 观察不同类群微生物的菌落形态特征
4. 掌握生理生化反应培养基的配置原理和一般方法步骤 5. 巩固无菌操作技术
二、 实验器材
1. 肉膏蛋白胨琼脂平板
牛肉膏 1.05g、蛋白胨 3.5g、NaCl 1.75g、琼脂 7g、水 350ml、pH 7.0~7.2、121 ℃灭菌20min。 2. 溶液和试剂 无菌水
3. 仪器和其他用品
灭菌棉签（装在试管内）、试管架、煤气灯或酒精灯、记号笔和废物缸等。
三、 实验原理
通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落。
四、 实验内容及步骤
1. 在标签纸上做好标记并贴在培养皿侧面。 2. 牛肉膏蛋白胨培养基的制备：
（1） 称量：准确称取牛肉膏 1.05g、蛋白胨 3.5g、NaCl 1.75g放入烧杯中。
（2） 熔化：在上述烧杯中加入少于所需的水量（所需水量为350ml），用玻璃棒搅匀，补充水到所需的总体积350ml。
（3） 调pH：用1mol/L NaOH和1mol/L HCl进行调节，直至溶液pH达到7.0~7.2。 （4） 分装：将其中200ml溶液装入500ml三角瓶中，向三角瓶中加入4.0克琼脂，向烧杯剩余液体中加入3.0克琼脂，在石棉网上加热烧杯，使琼脂溶解，将烧杯中溶液分装到10支试管中，每支试管中加入体积为试管总体积的1/5左右。
（5） 加塞：在三角瓶口上塞上棉塞，防止外界微生物进入造成污染。
（6） 包扎：加塞后，在棉塞外包一层牛皮纸，将全部试管用麻绳捆好（还有一支装有无菌水的试管），同样的方法把三角瓶包好，扎好。用记号笔注明培养及名称、组别、配制日期。
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（7） 灭菌：将上述培养基以0.1MPa，121℃，90min高压蒸汽灭菌。
（8） 搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将 试管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管的总长的一般为宜。 3. 倒平板：
点燃酒精灯，右手握住三角瓶底部，用左手小指将棉塞夹住，拔出，随之将瓶口边缘在火焰上过一下，杀死粘在瓶口外的杂菌。左手拿起一套平皿，用无名指和小指托住平皿底部，用中指和大拇指夹住皿盖并开启一缝，恰好能让三角瓶伸入，随后倒出培养基。倒入15~20ml培养基，铺满整个皿底。盖上皿盖，置水平位置待凝。重复上述操作，直至倒够所需数量。
4. 微生物的接种：
（1） 在火焰旁，半开皿盖，从试管中取出灭菌湿棉签，在手心上擦拭约2cm的范围，然后将棉签从平板的开启处伸**板表面，在培养基上涂抹，闭合皿盖，放回棉签。
（2） 在火焰旁，半开皿盖，从试管中取出灭菌湿棉签，在实验台面擦拭约2cm的范围，然后将棉签从平板的开启处伸**板表面，在培养基上涂抹，闭合皿盖，放回棉签。
（3） 取六个培养皿，在实验室打开皿盖，三个暴露5min，三个暴露10min，之后盖好皿盖，并做好标记。
（4） 取棉签在头发上擦拭2cm的范围，然后将棉签从平板的开启处伸**板表面，在培养基上涂抹，闭合皿盖，放回棉签。 5. 培养：
将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，从接触空气的两组共六个培养皿中各取出一个置27℃，其余所有置37℃，培养一星期。
6. 观察
（1） 观察菌落的形态，区分细菌与霉菌
（2） 对单个细菌的菌落进行描述，应该对菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录。
（3） 在不同的培养条件下对菌落的数量及种类进行比较,并找出不同培养条件下的相似菌，并对相似菌进行描述。
7. 划线分离与菌种的纯化
从第六步观察到的菌落中挑选两个进行划线分离操作。如图所示，先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划
线完毕后盖盖平放，贴好标签后在37℃条件下培养。同以上方法对另一菌落进行接种与培养操作。
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五、 实验结果
表一：细菌的描述 菌种 大小 3-2-空气-10’-37℃ 3-2-空气-5’-37℃ 3-2-空气-5’-37℃ 3-2-空气-5’-37℃ 3-2-手-37℃ 3-2-手-37℃ 小 小 小 小 小 大 橘红 金黄 乳白 黄色、边缘略白 淡黄 乳白色 不整齐 整齐 整齐 凹凸不平 锯齿状 花状
微凸、粗糙 光滑 扁平 微凸 四周凸中间凹 中心凸起 颜色 特征 边缘 表面 形态 不规则 圆形 圆形 不规则 圆形 不规则 干湿 湿润 湿润 湿润 湿润 干燥 湿润 量 1 5 1 1 2 1 数发现人 刘洋 刘沛余 吕赞 马华峥 刘洋 吕赞 表二：不同条件下细菌生长情况的比较 种类 空-5’-37℃ 空-5’-27℃ 空-10’-37℃ 空-10’-27℃
数量 9/8 8 10/14 12 种类 7/5 5 3/4 3 计数人 马华峥 吕赞 刘洋 刘沛余 表三：寻找相似菌株 相似菌株 1 2
3-2-空气-5’-37℃ 3-3-空气-2-10’-37℃ 3-2-空气-10’-37℃ 3-4-发-37℃ 特征 小；金黄；边缘整齐；表面光滑；圆形；湿润 小；橘红色；边缘不整齐；表面微凸粗糙；形状不规则；湿润 数量 各1株 各1株 六、 实验结果分析
1. 通过观察比较各个培养基上的菌落的形态及数目，置于空气中的平板中菌落种类更多样，原因：接触面大，空气流动性大，微生物种类数目较多。
2. 不同的环境下接种的微生物大多形态各异，因此可以说明不同的环境中微生物的种类变化较大。
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3. 从形态特征看可以知道菌落的特征,来分离菌落。
4. 通过比较在空气中放置5分钟后的培养皿在27摄氏度培养和37摄氏度培养两组的培养皿上的菌落数量，37摄氏度培养皿中的菌落数多于27摄氏度的培养皿中的菌落数，由此可推断出，37摄氏度的环境可能更加适合菌落的生长。
5. 通过比较在空气中放置10分钟后和5分钟的培养皿在37摄氏度培养后的菌落数量，可以认为在有菌条件中暴露时间越久，则染菌的数量越多。
6. 通过比较3-2-空气-10’-37℃和3-4-发-37℃，可初步推断头发表面的某些菌来自空气。
七、 问题与讨论
思考一：列举2-3类微生物，说明它们在本实验条件下（肉膏蛋白胨琼脂平板，37℃）不能生长。
因为牛肉膏蛋白胨培养基是用来培养细菌的,故不能培养真菌,例如酵母菌。其次实验是在37摄氏度进行，可能有些微生物不适合在此温度下培养。
思考二：比较各种来源的样品，哪一种菌落数和菌落类型最多？为什么？
菌落类型为手上最多。因为手接触了很多细菌或霉菌，包括空气中的，都可通过手的接触进入培养基。
思考三：比较洗手前后菌落数的变化，谈谈你的体会。洗手后仍有少量细菌生长，你认为是什么原因？
洗手前菌落数比洗手后菌落数少，但是菌种数目多。洗手前，多数菌落为霉菌，洗手后，大多数为小型细菌菌落，而且数量较多。猜测原因为，洗手前的平板，霉菌生长可能抑制了细菌生长，因而菌落数较少；洗手后，霉菌被除去，细菌生长不受影响，故细菌菌落较多。
思考四：完成本实验后，你是否已体会到我们生活在微生物的包围中？你如何体会“微生物既是我们的朋友又是我们的敌人”？
①生产方面：它们在土壤物质转化和促进植物生长有着极为重要的作用，例如根瘤菌，圆褐固氮菌都是将氮元素活化，让植物来利用的微生物。在生物工程方面，用酵母菌酿酒，用乳酸菌制酸奶，用毛霉制腐乳。还可以制造生物杀虫剂，如苏方金杆菌，日本金龟子芽胞杆菌，对人畜无害，是一种比较绿色的杀虫剂。然而，有一些微生物属于动植物细菌和病毒，给农牧业生产带来危害，如烟草花叶病毒，禽流感病毒。
②生活方面：当双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌在肠道内生长、繁殖，将阻止外面的病原体入侵肠道，构筑成一个生物屏障，对人的健康有益。也有一些我们经常听说的微生物对人的健康有害，如结核杆菌会引发结核病，流行感冒病毒会引发感冒等等。
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