Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2009 Vol.13, No.36
基础医学
全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化*★ 蔡 鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇
Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method
Cai Peng, Zhu Shao-xing, Su Yi-ming, Huang Shi-yong Abstract
BACKGROUND: There is few mesenchymal stem cells (MSCs) in the bone marrow, about one BMSC in 1×104-1×105 monocytes. Following in vitro isolation, purification and amplification, it is satisfactory for in vivo requirement. OBJECTIVE: To observe biological characteristics and potentiality of multi-directional differentiation of BMSCs in vitro. DESIGN, TIME AND SETTING: The cytological in vitro study was performed at the Institute of Urinary Surgery, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University from October 2007 to December 2008. MATERIALS: A total of 30 clean male Sprague Dawley rats of inbreeding line were supplied by Silaike, Shanghai, China. METHODS: BMSCs from rats were isolated and cultured in vitro by using the whole bone marrow adherence method. When 80%-90% confluency, BMSCs were digested by trypsin. At the third passage, BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. MAIN OUTCOME MEASURES: Cell morphology was observed under the inverted phase contrast microscope. BMSCs surface markers were detected using flow cytometry. Osteogenic ability was examined by alizarin red staining. Adipogenic ability was measured by Oil red O staining. RESULTS: The primary cells and the passage cells were mostly fusiform in shape, to be similar to fibroblasts. Cell still kept a high potential of growth and amplification following over 10 subcultures. At the third passage, BMSCs were positive for CD44, CD90, CD106, but negative for CD34, CD45, CD11b. Following 21 days of osteogenic induction, cell alizarin red staining showed that alizarin red was positive in osteoblasts. Following 2 weeks of adipogenic induction, oil red O staining showed that red lipid droplet existed in adipocytes. CONCLUSION: Whole bone marrow adherence method can isolate, purify and amplify BMSCs in vitro. The obtained cells have general biological characteristics of MSCs, and also have potentiality of multi-directional differentiation. Cai P, Zhu SX, Su YM, Huang SY.Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7073-7077. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]
摘要
背景：骨髓中的间充质干细胞含量极少，每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞，需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。 目的：观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。 材料：清洁级雄性近交系SD大鼠30只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，待细胞融合至80%~90%胰蛋白酶消化传代。取传至第3代细胞，分别向成骨、成脂方向诱导分化。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测其表面标记，茜素红染色检测其成骨能力，油红O染色检测其成脂能力。 结果：原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样，连续传代10代以上，细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力。第3代骨髓间充质干细胞CD90，CD44，CD106均呈阳性表达，而CD34，CD45，CD11b呈阴性。成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。成脂诱导2周后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。 结论：全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞，所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性，经诱导培养后具有多向分化潜能。 关键词：间充质干细胞；骨髓；生物学特性；分化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.36.014 蔡鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(36):7073-7077. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH Department of Urology, Union
Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Cai Peng★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Urology, Union
Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
warriormd@qq.com
Correspondence to: Zhu Shao-xing, Doctor, Chief
physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Urology, Union
Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China zsxing2005@126. com
Supported by: the Natural Science
Foundation of Fujian Province, No. C0710018*
Received: 2009-06-12 Accepted: 2009-07-25
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蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化
福建属协医科大学附外科，和医院泌尿市福建省福州
350001 蔡1982 鹏★，男，省漳年生，福建族，州市人，汉在读硕士，医师，福建医科大学主要在泌从事干细胞治疗方面的研究。尿外科疾病warriormd@qq. com
通讯兴，作者：朱绍师，博士，生导师，副教授，主任医硕士大学院泌尿外科，附属协和医福建医科省350001
福州福建市 zsxing2005@ 126.com
福建基(C0710018)*
金省自然科学资助项目
中图分类号:R394.2 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2009)36-07073-05
收稿日期：2009-06-12
修回日期：2009-07-25 (20090522021/ ZS·Q)
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0 引言
由于骨髓间充质干细胞具有诸多优势，其作为种子细胞在组织工程、细胞替代治疗、基因治疗等领域得到了日益广泛的应用[1-6]。但骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，每
1×104~1×105
个单核细胞中约有1个骨髓间充质
干细胞[7]，需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。
实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养方法，观测骨髓间充质干细胞生物学特性，及其成骨、成脂分化潜能，为后续进行基因修饰骨髓间充质干细胞及体内移植实验做好准备。 1 材料和方法
设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。
材料：清洁级雄性近交系SD大鼠30只，四五周龄，体质量80~100 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK沪2007-0005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
实验用主要试剂：
试剂 来源
低糖
DMEM细胞培养基、
Hyclone公司
优质胎牛血清
EDTA- 胰酶 Gibco公司
FITC 标记小鼠抗大鼠CD34、 ABD Serotec公司 CD90单克隆抗体
FITC
Biolegend公司 CD45
标记小鼠抗大鼠CD44、
、CD106、CD11b 单克隆抗体
茜素红、油红Sigma公司 成骨诱导分化培养液、成脂诱导
O
广州赛业公司
分化培养液
实验方法：
大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养：用1 mL
注射器抽取体积分数为10%水合氯醛0.3 mL腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。铺无菌单盖住大鼠上身，无菌条件下分离出双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM浸泡清洗。眼科剪切除两端骨骺，显露骨髓腔，用10 mL注射
器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓，反复冲洗待骨髓腔变白后停止。收集骨髓悬液于15 mL离心管中，1 000 r/min室温离心3~5 min；离心后去上清，用5 mL新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移
至25 cm2
培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为
5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。约48 h后首次换液，以后每两三天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。
大鼠骨髓间充质干细胞的纯化扩增：待细胞融合
至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS轻轻冲洗后，吸去PBS。加入2.5 g/L胰蛋白酶1.0~2.0 mL，于培养箱中温育1.0~2.0 min，置于显微镜下观察细胞形态变化，待镜下细胞之间突起消失、变圆后，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻吹打数次，转移至15 mL离心管，1 000 r/min室温离心5 min，弃上清，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，用吸管轻柔吹打成细胞悬液。计数板计数后，调整细胞密度，以5 000个/cm2接种于新的25 cm2培养瓶，置于37 ℃、含体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中继续培养。以后每两三天换液1次，此时细胞记为P1(第1代)，以后待细胞80%~90%融合后重复上述步骤进行传代。
流式细胞仪检测细胞表面标记：待P3细胞
融合至90%左右，吸去培养基，用PBS充分洗涤细胞2次，加入2.5 g/L胰蛋白酶室温消化1 min，加入新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，吸管仔细吹打，1 000 r/min室温离心7 min，弃上清，加PBS并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1×106，分装至EP管中，1 000 r/min室温离心7 min，弃上清，于待检测的样本中各加入90 µL PBS，轻轻吹打成细胞悬液，分别加入CD34，CD90，CD11b，CD106，CD44，CD45一抗及其同型对照各10 µL，充分吹打混匀，37 ℃避光孵育30 min后，测试前再加400 µL PBS至总体积500 µL，充分混匀，上机检测。
向成骨细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充
质干细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105/孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d后，诱导组加入2 mL成骨诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d换液1次。成骨诱导14~21 d后进行茜素红染色。
P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com
蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化
向成脂肪细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充质干
细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105
/
孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d后，诱导组加入2 mL成脂肪诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d换液1次。成脂肪诱导14 d后进行油红O染色，检测脂肪沉积情况。
设计、实施、评估者：设计为第一~三作者，实施为第一、三、四作者，由第二作者进行评估。均经过系统培训，未使用盲法评估。
2 结果
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察 原代培养： 刚接种时细胞呈圆形，多数悬浮于培养液中。 48 h后大部分细胞贴壁，换液除去未贴壁的细胞后，可见部分贴壁细胞形态不一，呈梭形的成纤维细胞样或多角形改变，核较大，位于细胞中央或边缘。 三四天开始出现散在的贴壁生长的成纤维样细胞。 五六天细胞呈克隆样生长的集落，集落细胞增殖迅速，见图1a。 7 d左右每个集落含有100~200个细胞，细胞形态基本为纺锤形的成纤维细胞样，部分呈宽大扁平的多边形。 9~11 d时融合成单层，一般能够达到90%甚至100%的细胞融合状态，梭型细胞纵轴相互平行排列，见图1b。 传代后： 传代细胞24 h内完全贴壁。 三四天细胞达到完全融合，呈均匀一致的纺锤形，见图1c，d。 连续传代10代以上，细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力，至融合状态所需时间无明显变化。 a: 5 days of primary culture
b: 9 days of primary culture
c: 4 days of P2 BMSCs
d: 4 days of P5 BMSCs
Figure 1 Morphological observation of rat bone marrow
mesenchymal stem cells (BMSCs) of primary and successively passaged culture(×100)
图1 原代及连续传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞形态观
察(×100)
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2.2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代骨髓间充质干细胞均一表达CD90，CD44，CD106，阳性率分别为91.50%，99.87%，78.02%；而CD34，CD45，CD11b呈阴性，阳性率分别为0.07%，0.15%，0.21%，见图2。
a b
c d e f g h
i
FITC-isotypism control was shown in Figure 2a and PE-isotypism control in Figure 2d, Figure 2h. The quantitative data of CD34 was
shown in Figure 2b,CD90 in Figure 2c,CD44 in Figure 2e,CD45 in Figure 2f,CD106 in Figure 2g,CD11b in Figure 2i, respectively
Figure 2
Surface marker expression of P3 rat bone marrow mesenchymal stem cells
图2 第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达
2.3 成骨诱导分化鉴定 成骨诱导21 d后茜素红染色，诱导组显示大量橘红色矿化结节形成，对照组呈阴性，见图3。
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蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化
a: Experimental group
3 讨论
人们逐渐认识到骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外，还含有产生非造血组织的间
[8]
充质干细胞。1968年，Friedenstein等首次对骨髓间
充质干细胞进行了描述，此后骨髓间充质干细胞受到学者的广泛关注，该细胞易于体外分离扩增，在适宜的条件刺激下可向多方向分化，遗传背景稳定，有内在的组织相容性。同时骨髓间充质干细胞还易于外源基因的转 b: Control group Figure 3 Alizarin red staining identification after bone marrow
mesenchymal stem cells were induced into osteoblasts(×100)
图3 大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后茜素红染色结
果(×100)
2.4 成脂诱导分化鉴定 成脂诱导2周后油红O染色，诱导组可见细胞以长梭形为主，胞浆内出现大量红染的脂滴，折光性较强，形态大小不一，成串排列或围绕细胞核分布，部分脂滴融合为较大团块，将细胞核挤向一边；对照组染色后细胞内未见红染脂滴，见图4。
a: Experimental group
b: Control group Figure 4 Oil red O staining identification after bone marrow
mesenchymal stem cells were induced into adipocytes(×200)
图4 大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化后油红O染色结
果(×200)
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染和表达，用前景[9-10]目前对于骨髓间充质干细胞分离纯化及体外培养还没有统一的方法，有些特殊标志来选法；有根据而采用细胞分离液也最简单的物的特性来式细胞仪技术干细胞，但对细胞的减低，甚至质干细胞尚未发现管采用密度单核细胞分间充质干细胞生中对骨髓间充质干细胞生物质，亦对细胞体外扩增有分离法分离骨髓间充质干细胞，胞贴壁生长而造离，虽然所在滋养细胞和长增殖旺盛度[14]。
实验采充质干细胞，质干细胞贴壁液去除悬浮消化酶的反应巨噬细胞、单核细胞的量和消化短时间内与贴壁较强仍贴胞得到进一形克隆样生或旋涡状。性影响小等优而在细胞治疗和基因治疗方面有
根据细胞大小或者细胞表面的一进行分离，即免疫磁珠法和流式骨髓间充质干细胞与其他细胞来分离，即密度梯度离心法；骨髓间充质干细胞易于即贴壁筛选法。利用免疫磁珠进行分选虽可获得高纯度的骨髓间充质活性影响较大，细胞增细胞活性完全丧失[11-12]，加之其特有的表面标志，故应用度离心法可以有效地将红细胞、白细胞、对细胞活性影响较小，但也破坏长的骨髓微环境，可能丢失长有利的细胞因子和不利影响[13]。而是根据骨髓间充质干细血细胞悬浮生长的特性对较复杂，但由于骨髓冲洗液中某些细胞因子，促使骨髓间充质干细胞生并且经换液传代后细胞仍可达贴壁分离法成功分离大鼠骨髓间原代细胞培养时增殖活力良好，生长，而造血系细胞悬浮生长的造血系细胞；再则根据各不同，传代时利用骨髓间充质干细胞易脱落的特点，严格间，使易于消化的骨髓间充质干细胞在底分离，而巨噬细胞、单核细胞因附于培养瓶底；从而使骨髓间充质干细纯化。经几次传代，细胞由变为形态均一、排列有序的一方法具有操作简便、快速点。在整个实验过程中，要获P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com良好的应细胞仪分度不同，而最早附塑料底法和流能力严重骨髓间充较少；尽了骨髓微环境促黏附贴壁进行分存很高的纯骨髓间充，每次换种细胞对较化酶的多角平行状活活性好、
因。密是根据黏分离，殖导致梯层且骨髓全骨髓二者得细胞成分，到用全骨髓长生掌握消时培养瓶步最初长梭形这、对细胞得
蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化
形态均一的骨髓间充质干细胞，需要严格的无菌操作。除基本的无菌要求外，在剪取大鼠的双下肢及剥离皮毛后，应更换器械，避免动物取材和分离骨髓间的交叉污染。骨髓间充质干细胞生长时密度依赖性极强[15]，应注意传代细胞的种植密度，以1∶2或1∶3的比例进行传代为宜。由于骨髓间充质干细胞很容易产生老化现象，因此注意传代时的融合程度，以尽量延缓骨髓间充质干细胞出现老化现象的时间。传代应注意掌握消化时间，以消化2.0~3.0 min，贴壁细胞突起开始收缩变形时进行轻柔吹打为宜。细胞传代六七代后，形态无明显变化，但扁平形的大细胞逐渐增多，梭形细胞减少。不添加任何生长因子，骨髓间充质干细胞经培养传代10代后，细胞生长未见老化现象。
骨髓间充质干细胞没有典型的形态特征，所以单凭光镜形态学、细胞大小、颗粒的有无等都很难鉴别骨髓间充质干细胞，而目前研究尚无发现骨髓间充质干细胞的特异性表面标记[16]。多数学者认为要鉴定骨髓间充质干细胞只能通过培养过程中出现的表面CD表型[17]，以及其具有成骨、成脂诱导分化的能力，综合推断是否为间充质干细胞。有研究表明，骨髓间充质干细胞缺乏CD14，CD34和CD45等造血谱系标志，但对SH2，SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD106，CD120和CD124等均呈现阳性反应[7，18]。实验通过流式细胞仪检测CD90，CD44，CD106，并通过脂多糖受体CD11b，CD34、白细胞普通抗原CD45的鉴定排除骨髓来源的造血干细胞，再通过成骨、成脂诱导分化培养检测所培养细胞的分化潜能。实验发现，在分离除去了造血祖细胞，又没添加任何刺激诱导物的情况下，所培养的第3代细胞稳定、均一地表达细胞表面抗原CD44，CD90，CD106，几乎不表达CD34，CD11b及CD45，并且第4代细胞在成骨、成脂诱导液的培养下，能成功地向骨细胞、脂肪细胞分化，证实所分离培养的细胞是实验所需要的骨髓间充质干细胞，为今后进一步进行基因转染及回输体内迁移与横向分化奠定了实验基础。
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来自本文课题的更多信息-- 课题价值：课题研究工作属于福建省自然科学基金项目
“转染神经生长因子的骨髓间充质干细胞治疗糖尿病性膀胱 功能障碍的实验研究”的一个组成部分。该项目主要内容为： 建立大鼠糖尿病膀胱模型，分离大鼠骨髓间充质干细胞，体 外培养并转入NGF基因，将表达NGF的骨髓间充质干细胞 注射于糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织内，观察骨髓间充质干细 胞在膀胱组织内的存活、分化和NGF基因在膀胱组织和支配 膀胱的脊神经节组织内的表达情况，以及对膀胱排尿功能的 影响，探索应用干细胞为载体进行NGF转基因治疗糖尿病性 膀胱功能障碍的有效性和可行性。而实验通过全骨髓贴壁培 养法可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，所获细胞 具有间充质干细胞的一般生物学特性，经诱导培养后具有多 向分化潜能，为后续干细胞移植和基因治疗提供理想的种子 细胞。 方法创新：实验主要通过全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间 充质干细胞，流式细胞仪检测其表面标记，体外诱导骨髓间 充质干细胞向骨细胞、脂肪细胞分化并鉴定。与以往文献技 术相比，通过更多的客观指标（流式鉴定和多向诱导分化相 结合）来鉴定所分离的细胞是否属于骨髓间充质干细胞。 偏倚或不足：由于课题属于福建省自然科学基金项目的 一个组成部分，而该基金项目后续实验要求将骨髓间充质干 细胞注射于糖尿病大鼠膀胱平滑肌组织内，观察骨髓间充质 干细胞在膀胱组织内的存活、分化，所以实验不足之处是没 有在体外尝试诱导骨髓间充质干细胞向膀胱平滑肌细胞分 化，如果能在体外建立一套有效的诱导骨髓间充质干细胞向 膀胱平滑肌细胞分化的体系将更加完善。
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