维普资讯 http://www.cqvip.com 第４７卷２００８年第１期 １月 中山大学学报（自然科学版） ＡＣＴＡ ＳＣＩＥＮＴＩＡＲＵＭ ＮＡＴＵＲＡＬＩＵＭ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳ ＳＵＮＹＡＴＳＥＮＩ Ｖｏ１．４７ Ｎｏ．１ Ｊａｎ． ２００８ 胞外ＡＴＰ对ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞胞内ｐＨ的影响 伍忠銮 ，左武麟 ，盛雪婷 ，李 琳 ，刘叔文 ，姜世勃 ，周文良 （１．中山大学生命科学学院，广东广州５１０２７５；２．南方医科大学药学院，广东广州５１０５１５； ３．关国纽约血液中心，纽约１００２１） 摘 要：利用激光扫描共聚焦显微镜（Ｃｏｄｏｃ￣ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）采用ｐＨ依赖的荧光探针Ｓｎａｒｌ＂一４Ｆ测量细胞胞内 ｐＨ（ｐＨｉ）方法，发现胞外ＡＴＰ能剂量依赖（１０—１ ０００￣ｍｏＨＬ）地降低人阴道上皮细胞株ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞 ｐＨｉ。当胞外加入２００￣ｍｏＨＬ ＡＴＰ时，能快速地使ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞ｐｈｉ降低，此降低的ｐｈｉ在洗脱ＡＴＰ后可迅速 恢复。这些结果表明胞外ＡＴＰ能引起ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞胞内酸化。 关键词：ＡＴＰ；ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７；胞内ｐＨ 中图分类号：Ｑ２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：０５２９－６５７９（２００８）０１－０１２３－０２ 时记录在浴液中加入ＡＴＰ前后的５８０／６４０ ｎｍ的荧 正常生育期妇女阴道液的ｐＨ在３．８～４．４之 间，这种特殊的酸性环境的维持对于病原体的防治 具有重要的意义。阴道和宫颈上皮细胞在维持和调 光强度之比，此比值反应ｐＨｉ的变化；用ｐＨ为 ６．４、６．８和７．２的ｐＨ校准溶液，在临用前都加入 终浓度为１０ Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ，绘制ｐＨｉ的校正曲 线；根据校正曲线算出相应的ｐＨｉ。实验结果通过 节阴道液的ｐＨ中起重要作用…，而上皮细胞ｐＨｉ 在调节上皮细胞的吸收和分泌即离子转运中起重要 作用 －３］。ＡＴＰ不仅是一种分布广泛的神经递质， 而且还是一种旁分泌或自分泌因子，调节多种生理 功能如调节男性生殖生理功能 。文献［５］报道 外源性核苷类物质能影响上皮细胞的ｐＨ．和离子转 运：胞外ＡＴＰ能引起人类不同种类上皮细胞如鼻 上皮细胞、前列腺上皮细胞、大动脉内皮细胞、心 肌细胞和支气管上皮细胞的胞内酸化，但未见胞外 ＡＴＰ对阴道上皮细胞的影响。本文报道胞外ＡＴＰ Ｌｅｉｅａ ＳＰ２配套软件获取，用Ｏｒｉｇｉｎ７．０软件进行分 析，以每片细胞记为一个单独实验。 ２结果 当ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞ｐＨｉ分别为６．４、６．８和 ７．２，它们的５８０／６４０ ｎｍ比值具有较好的线性关系 （图１），相关系数ｒ为０．９９９６。根据校准曲线算出 ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞的ｐＨｉ为７．０１８±０．０５７（ｎ＝７）， 与大多数细胞的ｐＨｉ相似。胞外ＡＴＰ呈剂量依赖 对人阴道上皮细胞株ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞ｐＨｉ的影响。 １材料与方法 地降低ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞ｐＨｉ（图２）。当在浴液中 加入２００￣ｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ时，能迅速引起ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７ 细胞ｐＨｉ下降０．１４３±０．０４６（ｎ＝３），当洗脱ＡＴＰ 后ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞ｐＨｉ能较快地恢复到原来水平 （图３）。由于ｐＨｉ被认为是驱动上皮细胞吸收或分 泌的一个终极调节者（ｅｎｄ－ｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）［ｓ Ｊ，而 胞外ＡＴＰ引起人类上皮细胞胞内酸化的机制在不 同上皮细胞不同 Ｊ，因而阐明ＡＴＰ降低ｐＨｉ的机 制对上皮细胞的功能具有重要意义。Ｈ 主要通过 １．１材料及仪器 ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞来自纽约血液 中心，Ｓｎａｒｆ一４Ｆ、Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ购自Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ公 司，ＡＴＰ购自Ｓｉｇｍａ公司，上皮细胞无血清培养液 购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。其他试剂为国产分析纯试剂。 ｐＨｉ实验用Ｌｅｉｃａ ＳＰ２ Ｃｏｎｆｏｅａｌ及其配套软件和ＡＬＡ —ＶＭ８八道灌流系统完成。 １．２方法ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞的培养及传代按文献 ［６］进行，种于６孔板内的圆盖玻片（直径为２ ｃｍ），第３天用于ｐＨｉ实验。ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞的 ｐＨｉ的测量参照文献［７—８］方法：Ｃｏｎｆｏｃａｌ的激 发波长为４８８ ｎｍ，发射波长（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ，Ｅｍ）分 别为５８０ ｎｍ和６４０ ｎｍ，用Ｌｅｉｅａ ＳＰ２的配套软件实 质子泵、质子通道和Ｎａ 一Ｈ 交换体进出细胞参 与多种生理过程¨ ，雌激素被报道是通过调控人 的阴道上皮细胞上的质子泵的功能而酸化阴道 液¨川。本研究结果显示ＡＴＰ的效应是酸化细胞 内液，该效应的生理功能及其机制还有待进一步实 验证明。 收稿日期：２００７—１２—０８ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０５７０２２９，３０７７０８１７） 作者简介：伍忠銮（１９７０年生），女，博士，讲师；通讯联系人：周文良；Ｅ—ｍａｉｌ：ｂｉｌｌｚｈｏｕ２００５８８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｎ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com １２４ 中山大学学报（自然科学版） 第４７卷 ｌ ｇ ０ ｌ ０∞ ｌ ｇ Ｊｌｕ Ｕｌ ｌ ５ ４ ３ ２ ● ０ ７．２ ｂ Ｔ ．．．０ ｛ 士 ７．０ 厶 ￡ ’：０ 善 ６．８ 笔 叠 Ｔ６ 墨０ ６．６ ０ Ｍ ｐＨｉ Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｈｄａｒ ＡＴＰ 图１ ｐＨｉ的校正曲线（ｎ＝３） 图２胞外ＡＴＰ降低ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞 图３ ２００ Ｉ￣ｍｏＬ／Ｌ ＡＴＰ对ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７ Ｆｉｇ．１ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐＨｉ的剂量一反应曲线（ｎ：３） 细胞ｐＨｉ的影（ｎ＝３） ＰＨｉ（ｎ＝３） Ｆｉｇ．２ Ｄｏｓｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａｌ ＡＴＰ Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ２００ Ｉ￣ｍｏＬ／Ｌ ＡＴＰ ｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｐＨｉ ｏｆ ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７ ｃｅｌｌｓ（ｎ＝３） ｐＨｉ ｏｆ ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７ ｃｅｌｌｓ ３结论 Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ—ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ 本研究建立了ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞ｐＨｉ的测量方 ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｃａｌ，ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ，ａｎｄ ｖａｇｉ— ｈａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ 法，并观察到胞外ＡＴＰ能引起ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７细胞胞 ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，１９９７，５７（４）： 内酸化，为进一步阐明其机制和生理功能打下基础。 ８４７—８５５． ［７］ 叩Ｈ０ＭＡＳ Ｊ Ａ，ＢＵＣＨＳＢＡＵＭ Ｒ Ｎ，ＺＩＭＮＩＡＫ Ａ，ｅｔ ａ１． 参考文献： １ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｅｒｈｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ［１］ ＧＵＲ０ＤＥＳＫＩ Ｇ Ｉ，ＨＯＰＦＥＲ Ｕ，ＬＩＵ Ｃ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｅｓｔｏｒ— ｃｅｌｌｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ［Ｊ］． ｇｅｎ ａｃｉｄｉｉｆｅｓ ｖａｇｉｎａｌ ｐＨ ｂｙ ｕｐ—・ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｎ ｓｅｃｒｅ－－ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９，１８（１１）：２２１０—２２１８． ｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｖａｇｉｎａｌ・・ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｐｉ・・ ［８］ ＭＡＲＴＩＮＥＺ—ＺＡＧＵＩＬＡＮ Ｒ．ＬＹＮＣＨ Ｒ Ｍ．ＭＡＲＴＩＮＥＺ ｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００５，１４６（２）：８１６— Ｇ Ｍ．ｅｔ ａ１．Ｖａｃｕｏｌａｒ—ｔｙｐｅ Ｈ．ＡＴＰａｓｅｓ ａｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ８２４． ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ［２］ ＨＡＲＶＥＹ Ｂ Ｊ，ＥＨＲＥＮＦＥＬＤ Ｊ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ ｐＨ ａｎｄ ｉｏｎ ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，２６５：Ｃ１０１５一 ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｔｏｎ ｐｕｍｐｓ ａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ［Ｊ］． Ｃ１０２９． Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ，１９８８，１３９：１３９～１６４． ［９］ ＨＵＭＥＺ Ｓ，ＭＯＮＥＴ Ｍ，Ｖａｎ ＣＯＰＰＥＮＯＬＬＥ Ｆ，ｅｔ ａ１． ［３］ ＬＵＢＭＡＮ Ｒ Ｌ，ＣＲＡＮＤＡＬＬ Ｅ Ｄ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌ— Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｉｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｌａｒ ｐＨ ｉｎ ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ｂｙ ＡＴＰ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，２８７（６）： １９９２，２６２（１）：Ｌｌ—ｌ４． Ｃｌ７３３—１７４６． ［４］ ＺＨＯＵ Ｗ Ｌ，ＺＵＯ Ｗ Ｌ，ＲＵＡＮ Ｙ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ［１０］ ＤＥＣＯＵＲＳＥＹ Ｔ Ｅ．Ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ［Ｊ］． ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ，２００３， Ｓｈｅｎｇ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ，２００７，５９（４）：４８７—４９４． ８３（２）：４７５—５７９． ［５］ ＵＲＢＡＣＨ Ｖ，ＨＥＬＩＸ Ｎ，ＲＥＮＡＵＤＯＮ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ［１１］ Ｇ０Ｒ０ＤＥＳＫＩ Ｇ Ｉ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｏｎ ｐｒｏｔｏｎ ｓｅｃｒｅ— ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ａｐｉｃａｌ ＡＴＰ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｉｎ ｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎ ｖａｇｉｎａｌ－－ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｐｉ－－ ｈｕｍａｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００２，５４３ ｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｏｐｓｔｍｅｎｏｐａｕｓｌａ ｗｏｍｅｎ［Ｊ］．Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ， （１）：ｌ３—２１． ２００５，ｌ２（６）：６７９—６８４． ［６ Ｊ ＦＩＣＨＯＲＯＶＡ Ｒ Ｎ，ＲＨＥｌＮＷＡＬＤ Ｊ Ｇ，ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｄ Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＡＴＰ ｏｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｏｆ ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７ Ｃｅｌｌｓ ｗｕ Ｚｈｏｎｇ—ｌｕａｎ ，ＺＵＯ Ｗｕ—ｌｉｎ ，ＳＨＥＮＧ Ｘｕｅ—ｔｉｎｇ ，ＬＩ Ｌｉｎ ，ＬＩＵ Ｓｈｕ—ｗｅｎ ，ＪＩＡＮＧ Ｓｈｉ—ｂｏ ＇ ，ＺＨＯＵ Ｗｅｎ—ｌｉａｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＵＮ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １ ０２７５，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０５ １ ５，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００２１，ＵＳＡ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｇｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ＶＫ２ ／Ｅ６Ｅ７ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ Ｓｎａｒｆ－４Ｆ，ｅｘｔｅｒｎａｌ ＡＴＰ（１０～１ ０００ ｔｘｍｏＬ／Ｌ）ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｉｎ－ ｄｕｃｅ ｐＨｉ ｄｅｃｒｅａｓｅ．Ｗｈｅｎ ａｄｄｉｎｇ ＡＴＰ（２００ ｉ￣ｍｏＬ／Ｌ）ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｕｆｆｅｒ．ｉｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ａ ｒａｐｉｄ ｐＨｉ ｄｅｃｒｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｕｐｏｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａｌ ＡＴＰ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｅｘｔｅｒｎａｌ ＡＴＰ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７ ｃｅｌｌｓ． ＫｅＶ ｗｏｒｄｓ：ＡＴＰ；ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７；ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ
