西红花球茎组织培养的研究

第３２卷　第１期　ＶｏＬ　３２　ＮＯ。１　西南师范大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２００７年２月　Ｆｅｂ．　２００７　文章编号：１０００—５４７１（２００７）０１—００６８—０５　西红花球茎组织培养的研究①　张　洁，　林春来，　王力超，　梁国鲁　西南大学同艺园林学院，重庆４００７１６　摘要：以球茎切块为外植体，ＭＳ为基本培养基，０．５　ｍｇ－Ｉ　６－ＢＡ和２　ｍｇ－Ｉ　２，４一Ｄ为激素，在（２０土２）℃，　黑暗环境下培养，可以获得９８　的愈伤组织诱导率．愈伤转入ＭＳ＋５．０　ｍｇ・Ｌ　６　ＢＡ＋５．０　ｍｇ－Ｉ　ＮＡＡ培养　基中，可诱导丛生芽的产生，将丛生芽切成单个不定芽后转移到Ｍｓ＋４．０　ｍｇ・Ｉ　６－ＢＡ＋０．５　ｍｇ・Ｌ　ＮＡＡ的　培养基中，光照条件下可诱导新生小球茎的产生．　关键词：西红花；组织培养；愈伤组织；丛生芽Ｉ小球茎　中圈分类号：Ｒ２８２．７１　文献标识码：Ａ　西红花（Ｃｒｏｃｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　Ｉ　．），又名番红花、藏红花，系鸢尾科番红花属球根类多年生草本植物。在国　外，西红花最初仅是作为染料栽培，１９世纪以来，由于其独特的香味，更被许多国家作为香料，广泛应用　于食品工业、美容化妆品中．西红花的药用部位为干燥柱头，有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效．柱　头中的有效成分，如西红花甙、西红花苦甙、西红花酸和西红花醛具有明显的抗癌作用，能破坏ＤＮＡ合成　酶系，抑制癌细胞ＤＮＡ和ＲＮＡ的生成ｕ　，以及抑制细胞蛋白激酶的活性和原癌基因的表达　］。近年来成　为新型抗癌药物的研究热点．由于西红花染色体是＿珊倍体，花粉败育高，开花后不能结实，要靠球茎繁殖，　而在栽培过程中球茎逐渐退化，球茎一般８　ｇ以上才能开花，球茎越大，开花越多，球茎越小，开花越小甚　至不开花，但小球茎通过种植技术逐年种植可使之变成能开花的大球茎．据张治国等（１９８６）统计，１　ｇ以下　小球茎经３年逐年种植才能达到６　ｇ重种球茎标准；１　ｇ重的小球茎要两年；３～５　ｇ重的要１年达此标准，　因此，子代小球茎百分率的提高会致使开花率降低，从而失去药用价值，不能满足市场的需求．如何生产　出大的种球茎、降低子代小球茎百分率是生产中提高西红花产量的关键所在．本实验以西红花球茎为外植　体，从激素浓度的配比使用上探讨诱导愈伤组织、丛生芽及小球茎的发生，探求一条人工繁殖西红花球茎　的途径，以期提高西红花的繁殖系数，解决球茎退化，种源紧缺等问题．　１材料与方法　１．１　材　料　西红花（Ｃｒｏｃｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　Ｉ　．）球茎来自重庆市药物研究所．　取材时间为４月底，西红花球茎正处于夏眠时期．　１．２培养条件　以ＭＳ为基本培养基，ｐＨ　５．８，市售白砂糖３０　ｍｇ・Ｉ　＿。，卡拉胶５．０　ｍｇ・Ｉ　…　．　①收稿日期：２００６　１０—２Ｏ　作者简介：张洁（１　９８２），女・重庆荣昌人。硕士研究生，主要从事细胞学和多倍体育种方面的研究　通讯作者；粱国鲁。研究员，博士生导师．　维普资讯 http://www.cqvip.com

第１期　张　洁，等：西红花球茎组织培养的研究　６９　愈伤组织及丛生芽在黑暗条件下诱导培养，新生小球茎在光照条件下诱导，ｌ　５００４２　０００　ｌｘ，每天光照　ｌ２　ｈ，温度均为（２０±２）℃．　１．３试验方法　将取同的西红花（Ｏ．２～１．０　ｇ）种球置于低温４℃处理４０　ｄ后，用０．５～１．０　ｍｇ・Ｉ　ＧＡ浸泡１　０　ｒａｉｎ，　剥取外层褐色皮膜后，流水冲洗４０　ｍｉｎ，转入７５　酒精消毒ｌ　ｒａｉｎ后，再用０．１＂／ｏ　ＨｇＣ１２消毒ｌ５　ｍｉｎ，无　菌水冲洗５次，再用０．１　ＨｇＣ１ｚ消毒５　ｍｉｎ，无菌水冲洗６次，彻底洗去残余的ＨｇＣｌ￣后放人无菌环境下　待接种．　１．３．１　接种及初代培养　将西红花小球茎切成８　ｍｍ左右大小，接种到不同激素浓度配比的ＭＳ培养基ｒｆ１，在２Ｏ℃黑暗条件下　诱导球茎愈伤组织．　１．３．２分化培养　将上述已长出愈伤的切块转入附加不同６一ＢＡ和ＮＡＡ浓度分化培养基中黑暗条件诱导丛生芽的分化　和增殖．　１．３．３诱导新球茎　经过黑暗条件下继代培养后，再于ｌ　５００４２　０００　ｌｘ，光照时间１Ｏ～１２　ｈ／ｄ的条件下，分割丛生芽，诱　导小球茎的再生．　２　结果分析　２．１　不同培养基对西红花愈伤组织诱导的影响　球茎切块接种在附加不同浓度６一ＢＡ和２，４　Ｄ或ＮＡＡ的ＭＳ培养基上，由于切口组织损伤，培养过程　中，切口周围先是逐渐变白变干，１５　ｄ左右，切口处表面张裂，长出少许松散型黄色颗粒状愈伤组织，继续　继代生长一个月后，部分愈伤组织形成致密的、光滑突起的表面，略带白色，有分化的趋势（图１）．　接种一个月后观察，结果如表ｌ所示，几种不同浓度激素配比都能产生愈伤组织，说明高浓度的２，４－Ｄ　对诱导愈伤组织有利，除此之外，少量的６一ＢＡ加以协同作用，促进细胞分裂．ＮＡＡ也能诱导愈伤组织，　但效果不如２，４－Ｄ．在诱导愈伤组织的过程中，笔者曾采用光照条件诱导愈伤，但结果发现，光照条件下常　常会出现球茎切块褐化的现象，有的甚至严重致死．黑暗条件下培养个别也会出现褐化现象，但程度较前　者轻，本实验采取缩短继代时间的方式减轻褐化现象，即一旦发现有轻微的褐化，立即转入新的培养基中　培养，反复多次继代，结果发现，褐化程度降低．　表ｌ　不同激素配比对愈伤组织诱导的影响Ｉ３０天统计）　Ｔａｂｌｅ　ｌ　Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｃｒｏｃｕｓ　Ｓａｔｉｖｕｓ　Ｉ　Ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　３０　Ｄａｙｓ）　培养Ｘ／ｍｇ－Ｉ　ＭＳ＋６　ＢＡ　Ｏ＋２，４一Ｄ　１　ＭＳ＋６　ＢＡ　Ｏ　卜　２，４一Ｄ　２　外植体数　２Ｏ　２Ｏ　２Ｏ　２Ｏ　２Ｏ　愈伤组织生长情７兄　颗粒状，黄色，生长缓慢，易褐化　颗粒状，黄褐色，生长缓慢，易褐化　颗粒状，黄色，生长较快，少量褐化　颗粒状，黄色，生长较快，不易褐化　小颗粒状，黄褐色，生长缓慢，容易褐化　愈伤组织诱导率／　８Ｏ　９５　９５　９８　２５　ＭＳ＋６一ＢＡ　Ｏ．２＋２，４一Ｄ　２　ＭＳ＋６一ＢＡ　Ｏ．５＋２，４一Ｄ　２　ＭＳ＋６一ＢＡ　Ｏ．５＋ＮＡＡ　Ｏ．２　２．２不同培养基对丛生芽诱导的影响　将已产生愈伤组织的球茎切块转入下列不同激素浓度配比的分化培养基中诱导丛生芽的增殖，此时，　球茎切块除在诱导愈伤的培养基中长出致密愈伤组织外，逐渐在光滑突起的表面分化出白色披针形的叶　片，随后发育出不定芽（图２），将产生的不定芽部分切下，转移到新鲜培养基上进一步继代培养，又会产生　维普资讯 http://www.cqvip.com

７０　西南师范大学学报（自然科学版）　第３２卷　更多的不定芽．此时球茎切块芽眼中的芽也会逐渐萌发形成顶芽和侧芽．　图ｌ球茎切块生成愈伤组织　Ｆｉｇ．１　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｌｌｕｓ　图２　愈伤组织分化的白色丛生芽　Ｆｉｇ．２　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｈｉｔｅ　Ｔｕｆｔｙ　Ｂｕｄｓ　表２表明，丛生芽的诱导和增殖需要较高浓度的细胞分裂素和生长激索，虽然较高细胞分裂素和较低　生长激素配比，丛生芽的诱导率也较好，但相对高浓度生长激素来说，显然效果不如前者．２，４一Ｄ与ＢＡ可　能起协同作用，但由实验结果看出，其几乎不能与高浓度的ＮＡＡ和ＢＡ共同作用，反而会抑制丛生芽的　生长．　表２不同激素配比对丛生芽诱导的影响（４０天统计）　Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｕｆｔｙ　Ｂｕｄｓ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　４０　Ｄａｙｓ）　在对球茎愈伤组织的诱导到继代１～２次诱导出丛生芽的过程中均是黑暗培养，对于丛生芽的进一步　增殖和分化，如表３所示，在黑暗条件下丛生芽的增殖率几乎１００　，而光照条件下，丛生芽的增殖率大大　降低，由此可见，光照对于丛生芽的诱导同样起到负面的作用．　表３　光照对丛生芽增殖的影响　Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｕｆｔｙ　Ｂｕｄｓ　２．３不同激素浓度对小球茎发生的影响　将已产生不定芽的球茎切块转入分化培养基中，继代１－－２次后，观察到丛生芽逐渐增殖，生成许多白　色丛生芽，将丛生芽分割成单个不定芽，转入下列分化培养基中。于光照条件下培养，不定芽迅速生长，芽　的叶鞘内逐渐生成绿色的幼叶，基部开始膨大，３０　ｄ左右发育为小球茎（图３—５）．　维普资讯 http://www.cqvip.com

第１期　张　洁，等：西红花球茎组织培养的研究　７１　图３　不定芽分化出绿色幼叶　Ｆｉｇ．３　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｅｎｄｅｒ　Ｌｅａｖｅｓ　图４　芽的基部开始膨大　Ｆｉｇ．４　Ｂｕｄ’Ｓ　Ｂａｓｅ　Ｓｔａｒｔｓ　ｔｏ　Ｅｘｐａｎｄ　图５　新生小球茎　Ｆｉｇ．５　Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｓｍａｌｌ　Ｃｏｒｍ　图６　球茎的褐化　Ｆｉｇ．６　Ｃｏｒｍ　Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　在植物组织培养中不同激素及其组合对植物器官形成有明显影响，从表４可以看出，培养基于含有　ＢＡ和ＮＡＡ的培养基中小球茎的诱导率可高达５０％，但在ＢＡ与２，４一Ｄ，ＧＡ的配比培养基中，虽能诱导　小球茎产生，但诱导率显然没有与ＮＡＡ　同作用效果好．　表４不同激素浓度对小球茎发生的影响　Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｅｗ—ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｃｏｒｍ　３　讨　论　有关西红花的组织培养中，曾经也报道过用Ｂ。、Ｗｈｉｔｅ等作为基本培养基，而培养于常用的Ｍｓ培养　基中，附加与本实验不同的激素，也同样诱导了丛生芽及小球茎的产生，由此可见，激素类型、配比及含量　是能否培养成功的关键．　西红花球茎在５～７月正处于夏眠时期，对外源激素的敏感性极低，导致愈伤组织的发生时间长，诱导　率低．本实验通过采用低温处理及赤霉素浸泡之后，可诱导球茎ｎ一淀粉酶、蛋白酶和其它水解酶的合成，　催化球茎内贮藏物质的降解，以供球茎的生长发育所需，从而提高对外源激素的敏感性，打破其休眠，加　速对生长物质的吸收．　维普资讯 http://www.cqvip.com

７２　西南师范大学学报（自然科学版）　第３２卷　在西红花的组织培养中，外植体褐变死亡是常见的问题之一，给诱导脱分化和芽再生造成重大障碍．　分化能力不强的愈伤组织，在分化过程中会出现褐化现象（图６）．随着愈伤组织形成进程表现出轻重不同　的褐化，初期褐化较轻，随着时间增加，残留的愈伤组织也逐渐褐化，褐化物堆积呈黑褐色，严重的造成愈　伤组织的部分死亡．褐化会发生在愈伤组织外闱，外周组织褐化可能为内部分化提供一种隔离条件，为外　源激素和内源激素之间形成一个缓冲协调区，如果褐化严重会造成危害．因此，在组织培养中应尽量避免　出现褐化现象，选择适当大小的外植体，适当减少每瓶的接种数目，缩短继代培养的时间，加入适当浓度　抗氧化剂（Ｖｃ、ＡＣ和ＰＶＰ），可以抑制褐化现象的发生．　此外，西红花组培苗的细胞及其超微结构尚未见研究，培养条件下组培苗的细胞结构、细胞核和染色　体变化，可通过切片、荧光染色、分带技术来观察，为西红花的品种选育和转基因工程提供保证．　参考文献：　Ｅｌｉ　赵　军，徐莺，颜钫，等．西红化愈伤组织的诱导与化柱愈伤组织的继代、悬浮培养［Ｊ］，四川大学学报（自然科学　版），２００１，３８（３）：４２１—４２４．　Ｅ２３　陈书安，王晓东，欧阳杰，等，藏红花球茎愈伤组织快速诱导的研究［Ｊ］．中药及天然药物，２００３，３８（４）：２５４　２５６，　［３］Ｄｉｎｇ　Ｂ　Ｚ，Ｂａｉ　Ｓ　Ｈ，Ｗｕ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ（）ｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃｏｒｍ　ｏｆ　Ｃｒｏｃｕｓ　Ｓａｔｉｓｕｓ　Ｌ［Ｊ］．Ａｃｔｄ　Ｂｏｔｄｎｉｃａ　Ｓｉｎ＆Ａ，１９７９，２１（４）：３８９．　［４］关萍，石建明．番红花球茎组织培养［Ｊ］．贵州农学院月报，Ｉ　９９５，１４（４）：４７—４９．　Ｌｓ］刘咏梅，谈１８６．　锋，李坤培．番红花的组织培养和植株再生［Ｊ］．西南师范大学学报（自然科学版），１　９９５，２０（２）：１８３—　［６］何凯，陈　放．藏红花球茎的快繁研究及其柱头ｃＤＮＡ义库的构建［Ｄ］．成都：四川大学，２００３．　［７］　杨永华，陆　军，马健平．藏红花愈伤组织诱导及其细胞培养的研究［Ｊ］．生物技术，１９９６，６（３）：１５—１７．　［８］Ｓ￣ｒｌｏ　Ｋ，Ｈｉｍｅｎｏ　Ｈ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｏｎ　ｏｆ　ｓａｆｆｒｏｎ（Ｃｒｏｃｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　Ｉ　．）ｓｔｉｇｍａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌ　ｌｕｒｅ，ｌ９８７，ｌ１：１　５９—１６６．　Ｅ９］　黄守印．番红花组织培养研究简报［Ｊ］．植物生理学通讯，１　９８７，６：１７　１９．　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓａｆｆｒｏｎ　Ｃｏｒｍｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｅ，　Ｉ　ＩＮ　Ｃｈｕｎ－ｌａｉ，　ＷＡＮＧ　Ｌｉ－ｃｈａｏ，　ＬＩＡＮＧ　ＧＵＯ—ｌｕ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｔ　Ｈｏｒｈｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７　１６，Ｃｈｉｎａ　．　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｒｍｓ　Ｏｆ　ｓａｆｆｒｏｎ　ｃｒｏｃｕｓ（Ｃｒｏｃｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａＳ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ　ｏｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　６一ＢＡ　０．５　ｍｇ／Ｉ　ａｎｄ　２，４一Ｄ　２　ｍｇ／ｌ　．Ｔｈｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ａｓ　ｈｉｇｈ　ａｓ　９８　．Ｔｕｆｔｙ　ｂｕｄｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｌｉ　ｗｅ！‘ｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ａｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＢＡ　５．０　ｒａｇ／　Ｌ　ａｎｄ　ＮＡＡ　５．０　ｍｇ／Ｉ　．Ｔｈｅ　ｔｕｆｔｙ　ｂｕｄｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｎ　ａ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　６－ＢＡ　４．０　ｒａｇ／Ｉ　ａｎｄ　ＮＡＡ　０．５　ｒａｇ／Ｉ　，ａｎｄ　ｃｏｒｍｌｅｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｒｏｃｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ；ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔ　ｕｒｅ；ｃａｌｌ　ｕｓ；ｔ　ｕｆｔｙ　ｂｕｄ；ｃｏｒｍｌｅｔ　责任编辑欧宾