制备DH5α的感受态细胞并进行转化

制备DH5α的感受态细胞并进行转化

一．制备DH5α的感受态

（1）将DH5 菌液在无抗的LB平板上划线，37℃过夜培养

（2）从平板上挑单菌落，接种于5mlLB液体培养试管中，37℃过夜培养

（3）按照1:100的比例吸取菌液接种于250ml摇瓶中（含100mlLB培养 基）中，37℃，200rpm振荡培养2.5小时。在600nm下测其OD值 达到0.4-0.6之间即 可（菌的对数生长期）

（4）将菌液转入50ml预先预冷的灭菌离心管中，冰浴30min，4℃， 5000rpm，离心10min

（5）弃上清液，加入20ml预先预冷的0.1MCacl2，先加入5ml吹打混 匀，再加入

15ml混匀，4℃，5000rpm，离心10min

（6）弃上清液，将预冷的50%甘油400uL和0.1MCacl2 600uL加入1ml 离心管

中并混合均匀，使其甘油的最终浓度为20%。将其吹打混匀 后，以 100uL/管（放在冰

上）分装于1.5mlEP管中，标注后冻存于 -80℃冰 箱中。

二．DH5α的感受态的转化

（１） 取80-100uL感受态细胞于1ml离心管中，并将其放在冰中，再加入10uL

预冷的连接产物，混匀。(轻轻手弹混匀即可，不要吹打出气泡)

（２） 离心管0℃，冰浴30min

（３） 将离心管放入４２℃水浴锅中，热激45ｓ，迅速将离心管放回冰中5min

（４） 向离心管中加入，500uL不含抗生素的SOC media，37℃静止培养1h

（５） 离心管6000r,30s,吸取100uL上清液，弃其余上清液，用100uL上清液吹打混匀菌体沉淀。

（６） 将菌液加入相应质粒抗生素抗性（加AMP）的平板上，用灭菌的玻璃珠涂布，待菌液被琼脂吸收后，37℃倒置过夜