植物生物化学实验 (1)

一、实验目的

1、了解还原糖含量测定原理，并掌握测定技术。

2、通过实验加深对玉米秸秆组成和半纤维素降解方法的理解。 二、实验原理

植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素和木质素等物质组成。纤维素组成微细纤维，构成植物细胞壁的网状骨架，而半纤维素和木质素则是填充在纤维之间和微细纤维之间的“粘合剂”和“填充剂”，一般植物中这3种成分的质量约占植物干重的80-95%。玉米秸秆中纤维素含量为38%，半纤维素含量为24%，木质素含量为18%。半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，其主要成分是木聚糖，约占植物细胞干重的7-35%。木聚糖的结构是一种多聚五碳糖，由β-D-1,4木糖苷键连接起来，并带有多种取代基。木聚糖部分降解可形成低聚木糖，彻底降解则得到五碳单糖：木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖为主。其中玉米秸秆的木聚糖结构及相关降解酶系如图1所示：

Endoxylanase: 内切木聚糖酶；-Xylosidase: -木糖苷酶；-Glucuronidase: -葡萄糖醛酸酶；

-Arabinofuranosidase: -阿拉伯呋喃糖苷酶；Acetyl Xylan Esterase: 乙酰木聚糖酯酶

图1 玉米秸秆木聚糖化学结构

但由于木质纤维原料致密复杂的结构及纤维素分子高度结晶特性，需要进行适当的预处理，以降低纤维素的结晶度，增加纤维原料的多孔性，脱除木质素的

保护作用，增加酶与底物的接触面积，从而提高酶解的效率。采用的预处理方法应满足以下要求:①有利于酶水解过程的糖化;②避免碳水化合物的降解或损失;③避免生成对后续水解或发酵有害的副产物;④经济可行。预处理方法归纳起来包括物理法、物理化学法、化学法和生物法。

目前常用的木质纤维原料水解糖化工艺是酸碱水解和酶水解方法，酶水解工艺因其反应条件温和、水解副产物少、糖化得率高以及对环境危害小等优点，所以得到了更为普遍的认可和推崇，目前被大多研究者所广泛采用。稀酸预处理通常采用0.3~3%的H2SO4于110~220℃下处理一定时间。由于半纤维素被酸水解成单糖，纤维残渣形成多孔或溶胀型结构，从而促进了酶解效果。但稀酸预处理对纤维原料中木质素的脱除效果不佳，这在一定程度上也了纤维原料的酶解效率。碱法预处理是利用木质素能够溶于碱性溶液的特点，脱除木质素，引起木质纤维原料润胀，导致纤维内部表面积增加，聚合度降低，结晶度下降，从而促进酶水解的进行。碱法预处理的机理在于OH-能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键。常用的碱包括NaOH、KOH、Ca(OH)2和氨水等。

本实验采用碱法预处理玉米秸秆后，再用木聚糖酶和木糖苷酶酶解，测定预处理前后的还原糖量，来计算碱法预处理和半纤维素酶酶解的效率。 三、实验材料和设备 1、实验材料

玉米秸秆采自苏北农村，经过实验室小型高速粉碎机粉碎过筛。 半纤维素酶为实验室基因工程菌所产的内切木聚糖酶和木糖苷酶。 2、试剂的制备

（1）DNS溶液配置：称取3，5—二硝基水杨7.5 g，NaOH固体14.0 g充分溶解于1000 ml蒸馏水（水先煮沸10 min）中。加入酒石酸钾钠216.0 g，苯酚5.5 ml（在50℃水浴中融化或称取结晶苯酚6.0 g），偏重亚硫酸钠6.0 g，充分溶解稍冷却后置于棕色瓶中避光保存5天以上使用。

（2）1 mg/ml的木糖标准溶液：准确称取100 mg分析纯的木糖（预先在105℃下干燥至恒重），用蒸馏水溶解并定容至100 ml。 （3）2% NaOH

（4）25 mmol pH5.0的磷酸缓冲液

甲液：称 KH2PO4 17.01 g，加蒸馏水至500 ml。 乙液：称 NaHPO4 44.77 g，加蒸馏水至500 ml。

取甲液 ml加乙液 ml，即成 pH 5.0，0.25 mol/l的缓冲液，使用前需稀释10倍。

（5）5 mol/l CuSO4溶液 （6）5% （v/v）Tween-80 3、器材

紫外分光光度计、三角瓶（250 ml）、吸量管、恒温水浴、秒表、25 ml比色管、电炉、锅。 四、实验步骤

1、NaOH预处理：100 g粉碎后秸秆，按1：8的固液比加入2% NaOH搅匀，85oC水浴75 min，抽滤，残渣水洗至中性，称重。滤液测定还原糖量和体积数。 2、三角瓶批式酶解NaOH处理过的纤维残渣为底物，加入酶制剂在一定的pH、温度、转速等条件下取样测定还原糖含量。温度为45oC，pH为5.0，转速为150 r/min，底物浓度为2.5%于20 ml体系中酶解24 h，在试样中，添加60 IU/ml的木聚糖酶降解秸秆，加入Cu2+离子浓度为5 mmol/l和 0.05% （v/v）Tween-80。抽滤，残渣水洗，称重。滤液测定还原糖量和体积数。 3、还原糖的测定：

（1）木糖标准曲线的制定：将9支干燥洁净的试管编号，按下表所示加入试剂并摇匀。 序号

0

1

2

3 0.6 1.4

4

5

6

7

8

9

1mg/ml木糖标液（ml） 0.0 0.2 0.4 双蒸水（ml） DNS（ml）

2.0 1.8 1.6 3

0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

置于沸水浴中煮5 min，然后用冷水冷却，并用蒸馏水定容至25 ml。将各试管溶液摇匀以0号管为空白调零测定其余各管550 nm处的相对吸光度。以A550为纵坐标，浓度c为横坐标，制定标准曲线，y（A550）=ax（c）+b。

（2）样品测定：取2 ml经适当稀释后的样品液，各加入3 ml DNS液混匀后，

置于沸水浴中煮沸5 min，取出后冷却，并用蒸馏水定容至25 ml并充分混匀，在550 nm下测吸光度A值。对照以缓冲液代底物。 4、计算

（1）还原糖量的计算

还原糖量（%)y-baM(mg)稀释倍数(mg/ml)V(ml)100%

（2）酶解得率计算

半纤维素酶酶解得率C0.9V固体质量30%10000.5稀释倍数

实验二 脂肪酶活性测定方法

一、实验目的

1、了解脂肪酶活性测定原理，并掌握测定技术。 2、通过实验加深对酶活力和比活性含义的理解。 二、实验原理

脂肪酶催化脂肪水解，生成脂肪酸和甘油，产生的脂肪酸可以用标准碱液滴定，从而作定量测定。

C17H22COOH+NaOH→C17H33COONa+H2O

三、实验材料和设备 1、试剂的制备

（1）25%聚乙烯醇橄榄油乳化液的制备

称取3 g聚乙烯醇，加蒸馏水150 ml，加热溶解成2%溶液，向其中加入50 ml橄榄油，用高速组织捣碎机搅动。5000 r/min，搅动5 min，间歇五分钟，共三次。即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。 （2）0.025 mol/l磷酸缓冲液

甲液：称 KH2PO4 17.01 g，加蒸馏水至500 ml。 乙液：称 NaHPO4 44.77 g，加蒸馏水至500 ml。

取甲液13 ml加乙液100 ml，即成 pH 7.5，0.25 mol/l的缓冲液，使用前需

稀释10倍。

（3）0.05 mol/l NaOH标准溶液

称取分析纯约200 g，加蒸馏水至1000 ml，用标准邻苯二甲酸氢钾（或用标准草酸）标定后备用，使用前稀释至0.05 mol/l。 （4） 95%乙醇，酚酞指示剂

称取酚酞1 g，溶于100 ml 70%乙醇中。 2、酶液的制备

取一定量的脂肪酶菌液，10,000 r/min 4℃下离心五分钟去除菌体，离心完成后将上清液倒至标记好的三角瓶中，立即放入4℃冰箱中保存，保存时间不宜过长。 3、器材

三角瓶（100 ml）、吸量管、恒温水浴、秒表、碱式滴定管、高速组织捣碎、电炉、锅 四、实验步骤 1、酶活测定

（1）将一部分酶液置于电炉煮沸五分钟失活，待用。

（2）取100 ml锥形瓶两个，做好标记，每瓶中分别加入5 ml 0.025 mol/l磷酸缓冲液，和4 ml 25％聚乙烯醇橄榄油乳化液（乳化液在用之前，一定要重新乳化两遍）置于35℃水浴保温5 min。

（3）分别向两个锥形瓶中加入1 ml酶液和失活酶液，从加入开始精确计时，继续保温15 min。

（4）取出后立即加入95％乙醇15 ml，以停止酶反应（两个锥形瓶都要加乙醇）再加入15 ml去离子水（便于观察颜色）。分别加入酚酞指示剂3滴，用0.05 mol/l氢氧化钠滴定，并且在30 s内不褪色为止。。 2、酶活计算

本实验规定，1 ml酶液在40℃作用于聚乙烯醇橄榄油乳化液15 min，最后消耗1 ml 0.05 mol/l氢氧化钠,作为100个酶活单位

1 ml酶液活性单位（U）=(V样－V空)☓100☓稀释倍数

酶的比活性规定：每分钟分解底物释放1umol游离的脂肪酸所需的酶量定义

为一个脂肪酶活单位。

X=(B-A)×c×n×106×10-3/15

X---样品的酶活力，U/l；

B---滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积，ml； A---滴定空白时消耗NaOH标准溶液的体积，ml； c---NaOH标准溶液浓度； n---酶液稀释倍数。 注意事项：

1、用不同聚合度的聚乙烯醇，测出的数据不同，故应该使用同一聚合度的聚乙烯醇，才能进行比较，贮放的乳化液若上层有游析出，应重新搅动再乳化后才能使用。

2、磷酸氢二钠以含结晶水的为好，不含结晶水的易吸潮。

3、0.05 mol/l NaOH不宜多配，以免存放后与空气中的CO2作用生产碳酸钠影响浓度。

4、酶浓度以样品和对照之间耗碱差2-5 ml为宜。