第３６卷第３期 ２ ０ １ ５年９月 国外医学医学地理分册 Ｆ０ＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＳＥＣＴ１０Ｎ ＯＦ ＭＥＤＧＥＯＧＲＡＰＨＹ Ｖｏ１．３６ ＮＯ．３ Ｓｅｐ．２０１５ ‘２２７。 ◇临床医学◇ 乙肝表面抗原酶联免疫试剂性能验证 王卫才 （陕西省商州区妇幼保健院，陕西西安 ７２６０００） 摘要：目的 对使用的乙肝表面抗原酶联免疫试剂盒性能指标进行验证，为实验室选用合格方法和试剂提供依据 方法评价试剂盒的正确度、重复性、检出限。其中正确度验证采用统计２０１４年卫计委感染性疾病血清标志物Ａ能 力比对结果，要求符合率≥８Ｏ ；重复性验证采用对临界值一２Ｏ 、临界值＋２Ｏ 样本进行连续１０ ｄ检测，要求一致 性≥９５ ：通过对临界值附近不同浓度样本的检测，获得阳性率≥９５ 的最低浓度作为检出限的确认标准。结果 ２０１４年卫计委感染性疾病血清标志物Ａ能力比对，本院乙肝表面抗原符合率为ｉ００％；对临界值一２Ｏ 、临界值 ＋２Ｏ 样本１０ ｄ ２０次检测，一致性分别为９５ 、１００ ；在对０．６８ Ｉｕ／ｍＬ乙肝表面抗原标准物质检测中，阳性率为 ｉ００ 。结论北京万泰公司乙肝表面抗原酶联免疫试剂盒正确度、重复性能满足本院质量目标要求，在使用奥斯邦 （ＡｕｓＢｉｏ—ＳＴＡＲ、Ｆａｍｅ）全自动酶标分析仪时检出限为０．６８ ＩＵ／ｍＬ。 关键词：乙肝表面抗原；酶联免疫；正确度；重复性；检出限 中图分类号：Ｒ５１２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１—８８８３（２０１５）０３－０２２７—０３ Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ＷＡＮＧ Ｗｅｉ—ｃａｉ （Ｍａｔｅｒｎａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｚｈｏｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ７２６０００，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ｋｉｔ，ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉ１ｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｔ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｉｎ ２０１ ４，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｗａｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｂｅ≥８０％．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｃｕｔ—ｏｆｆ一２０ ａｎｄ ｃｕｔ—ｏｆｆ＋２０ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｉｎ １０ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｗａｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｂｅ≥９５ ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｎｅａｒ ｃｕｔ—ｏｆｆ， ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ≥９５ ｗａｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｗａｓ １００％．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｏｆ ｃｕｔ—ｏｆｆ一２Ｏ ａｎｄ ｃｕｔ—ｏｆｆ＋２Ｏ ａｓ ９５ ａｎｄ １ ００ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ０．６８ ＩＵ／ｍＬ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ １００ ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｍｅｅｔｓ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ．Ｗｉｔｈ ＡｕｓＢｉｏ—ＳＴＡＲ，Ｆａｍｅ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｔ ｗａｓ ０．６８ Ｉｕ／ｍＬ． ＫＥＹ ＷｏＲＤＳ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ；ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ；ａｃｃｕｒａｃｙ； 乙肝表面抗原是乙型肝炎病毒的外壳蛋白，存在 于乙肝患者血液、唾液、乳汁、汗液、？目水、鼻咽分泌 物、精液及阴道分泌物中，作为乙肝病毒重要的标志 物，通过对上述样本特别是血液样本的乙肝表面抗原 检测，为临床诊断患者是否感染乙肝、乙肝治疗效果 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—８８８３．２０１５．０３．０１７ 评价以及血源性安全筛查的重要依据。对血液样本 乙肝表面抗原检测，主要分为发光法定量和酶联免疫 吸附法定性２种。酶联免疫吸附法因为价格低廉，对 收稿日期：２０１５—０３—１５ 修回日期：２０１５－０４—２３ 作者简介：王卫才（１９７０一），男（汉族），主管检验师．研究方向：临床生 化检验． ｈｔｔｐ：／／ｇｗｙｘ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｅｄｇｅｏｇｒａｐｈｙ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ・２２８・ 国外医学医学地理分册 第３６卷 仪器要求较低，操作简便，目前仍然是中国临床实验 室首选的常规方法。中国是乙型肝炎病毒感染大国， 如何保证乙肝患者能有效检出和用血安全，主要取决 于诊断试剂的性能，为此，本研究对乙肝表面抗原酶 性方程使用生理盐水配制临界值附近浓度样本的２０ 次检测，其中临界值（０．５７ ＩＵ／ｍＬ）、临界值＋２０ （Ｏ．６８ ＩＵ／ｍＬ）样本阳性率分别为８０ 、１００ ，表明 乙肝表面抗原浓度在≥０．６８ ＩＵ／ｍＬ情况下，使用北 京万泰乙肝表面抗原酶联免疫试剂可被稳定检出，该 浓度即为检出限（表３）。 表１ 万泰酶联免疫试剂乙肝表面抗原正确度评价（２０１４年 卫计委感染性疾病血清标志物Ａ室间质评） 联免疫吸附法试剂盒性能指标进行了评价，并与厂商 声明进行比较，报道如下。 １材料与方法 １．１ 样本 由卫计委临检中心２０１４年感染性疾病 血清标志物Ａ室间质评物。 １．２仪器 奥斯邦（ＡｕｓＢｉｏ—ＳＴＡＲ、Ｆａｍｅ）全自动 酶标分析仪。 １．３试剂Ａ北京万泰生物药业股份有限公司乙 肝表面抗原酶联免疫试剂盒，批号：Ｂ２０１３１１２７、 Ｂ２０１４０３０６；Ｂ：康彻斯坦乙肝表面抗原标准物质，浓 度：４ ＩＵ／ｍＬ批号：２０１５０１００１。 １．４方 法 １．４．１正确度评价 统计２０１４年卫计委临床检验 中心感染性疾病血清标志物Ａ室间质评的结果，计 算符合率，符合率≥８Ｏ ，正确度验证通过。 １．４．２检出限确认将乙肝表面抗原标准物质采用 生理盐水稀释制备系列浓度样本，对制备好的系列浓 度的样本进行ＥＩ ＩＳＡ双孔检测，以测得的吸光度均 值为得到Ｙ轴，浓度为ｚ轴，通过进行曲线拟合，得 出标准曲线。根据制作的标准曲线，使用生理盐水稀 释标准品制备得到系列临界值附近浓度样本（浓度分 别为临界值一２０ 、临界值、临界值＋２０ ），对临界 值附近浓度样本进行连续２Ｏ次测定，当实验结果阳 性率≥９５ 的最低浓度确认为检出限。 １．４．３ 重复性评价根据标准曲线使用生理盐水稀 释乙肝表面抗原标准物质制备ｌ临界值＋２０ 浓度和 临界值一２Ｏ 浓度样本，对该样本每目测定２次，连 续１０ ｄ，一致性≥９５ ，验证通过。 ２ 结 果 ０．４ ０．Ｏ８９ ３ ０．０９４ １ ０．０９１ ７ 注：Ｎ：非反应（阴性）；Ｒ：反应性（阳性） 表２ 乙肝表面抗原标准物质不同稀释浓度ＥＬ１ＳＡ检测结果 ０．８ １．６ ２ ３ ４ ０．１４５ ６ ０．２５１ ３ ０．４０６ ８ Ｏ．５４９ ２ Ｏ．８１８ ８ Ｏ．１５７８ ０．１５１ ７ Ｏ．２７１ ９ ０．４３１ ８ ０．２６１ ６ ０．４１９ ３ ２．１ 正确度评价 ２０１４年本院选用万泰酶联免疫 试剂盒参加卫计委感染性疾病血清标志物Ａ乙肝表 ０．５ｌ３ ２ ０．７８３ ９ Ｏ．５３１ ２ ０．８Ｏ１ ４ 面抗原室间质评，１５个样本，本院检测结果与预期值 一致，符合率为１００ ，见表１。 ２．３ 重复性评价 对临界值－－２０ 和临界值＋２Ｏ 乙肝表面抗原标准物质，采用北京万泰乙肝酶试剂连 续１０ ｄ（每日测定２次）测定，在该批样本检测中室内 质控均在控制范围，其中临界值一２ｏ 样本阴性率为 ９５ （１９／２０），临界值＋２Ｏ 样本阳性率为１００ （２０／２０），一致性均符合≥９５ 的标准，重复性验证通 过（表３）。 ２．２检出限确认 对浓度为４ ＩＵ／ｍＬ的乙肝表面 抗原标准物质使用生理盐水配制的６个浓度样本检 测，以测得的吸光度均值为得到Ｙ轴，浓度为ｚ轴， 通过进行曲线拟合，得出标准曲线线性方程为 一 ０．１９４ｚ一０．００５ ４，相关系数Ｒ ＝０．９８１ １，表明该批 样本浓度与吸光度相关性较好（表２、图１）。根据线 ｈｔｔｐ：／／ｇｗｙｘ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｏｎ；Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｅｄｇｅｏｇｒａｐｈｙ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 第３６卷 ９ ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ １ ０ 王卫才．乙肝表面抗原酶联免疫试剂性能验证 剂盒的检出限、正确度、重复性进行了验证。正确度 采用了本院参加的卫计委２０１４年感染性疾病血清标 志物Ａ ５次结果的统计，按照ＰＴ能力验证评价标准 （符合率≥８０ ），本院阳性符合率、阴性符合率、总符 合率均为１００ ，正确度验证通过。本研究以乙肝表 面抗原阳性率≥９５ 的最低浓度作为检出限评价标 准，对临界值附近（包括临界值、临界值＋２０％）不同 浓度水平的乙肝表面抗原标准物质检测中，临界值 浓度（ＩＵ／ｍＬ） （０．５７ ＩＵ／ｍＬ）、临界值十２０ （０．６８ ＩＵ／ｍＬ）样本阳 图１ 乙肝表面抗原标准物质不同稀释浓度ＥＬＩＳＡ 检测线性图 表３ 乙肝表面抗原重复性评价结果 性率分别为８Ｏ 、１００ ，表明北京万泰乙肝表面抗 原酶联免疫试剂在奥斯邦（ＡｕｓＢｉｏ—ＳＴＡＲ、Ｆａｍｅ）全 自动酶标分析仪检出限为０．６８ ＩＵ／ｍＬ。重复性评 价参照ＣＬＳＩ—ＥＰ１２Ａ，本研究对临界值一２Ｏ 、临界 值＋２Ｏ 浓度的乙肝表面抗原标准物质进行了连续 ２Ｏ天（每日２次）检测，临界值一２ｏ 阴性率为９５ （１９／２０），临界值＋２０ 阳性率为１００％（２０／２０），按 照验证标准（一致性≥９５ ），重复性验证通过。在重 ３讨论 复性评价时发现，对于万泰公司乙肝表面抗原酶联免 疫试剂盒说明书给定的吸光度临界值为０．１０５，我们 在对临界值一２ｏ 、临界值＋２０ 浓度的样本检测 时，都能分别获得≥９５ 阴性率和阳性率，表明试剂 盒说明书给定的临界值水平适应于本实验室检测，对 乙肝表面抗原检测作为诊断是否感染乙肝的最 重要的诊断实验，试剂盒质量的好坏将极大影响实验 结果，目前乙肝表面抗原酶联免疫检测试剂国内生产 厂家较多，质量也参差不齐。在尽可能规避漏检和假 阳性结果的前提下，如何选择性价比高，质量稳定的 试剂一直是实验室关注的焦点，这就需要实验室在选 于超过临界值２ｏ ９／６浓度的样本，将得到稳定结果。 综上所述，通过对北京万泰乙肝表面抗原酶联免 疫试剂盒正确度、重复性验证表明，该试剂能满足本 院质量目标要求，在奥斯邦（ＡｕｓＢｉｏ—ＳＴＡＲ、Ｆａｍｅ） 定某种试剂前应该对其性能指标进行评估。对于临 床免疫定性检验领域对试剂盒性能指标验证内容无 明确的行业标准，国内已经报道的文献验证包括了正 确度、重复性、精密度、检出限、临界值（１、２、３、５），中 全自动酶标分析仪检出限为０．６８ ＩＵ／ｍＬ，可以为临 床提供稳定可靠的结果。 参考文献 ［１－１李俊立．ＥＬＩＳＡ法ＨＢｓＡｇ试剂盒检测限确定及技术对策［Ｊ］．现 代检验医学杂志２００６，２０（２）：３５．３７． ［２］李金明．定性测定的性能验证［Ｒ］．中国医院协会临床检验管理专 业委员会，２０１１． 国合格评定国家认可委员会（ＣＮＡＳ）指出，验证内容 至少包括检出限、符合率 ］。精密度作为性能验证最 基本的指标，常以标准差或变异系数来表示，定量检 测多采用这种方式进行，但免疫学定性实验中影响因 素较多，标准差或变异系数较大，标准差或变异系数 不能客观反应定性检测的精密度，为此，ＣＬＳＩ对定性 Ｅａ３臧亮，王东，邓雪莲，等．ＩＳＯ１５１８９在酶联免疫检测性能验证方法 的探讨ＥＪ７．中国输血杂志，２０１４，２７（７）：６８９．６９１． ［４］江涛，李军，王昌富，等．基于ＩＳＯ１５１８９要求的免疫学定性试验性 能验证方法的探讨［Ｊ］．国际检验医学杂志２０１４，３５（３）：３３２．３３３． 检测性能评价中采用重复性代替精密度，以一致性作 为评价指标 ｊ。 本院选用的北京万泰乙肝表面抗原酶联免疫试 ｈｔｔｐ：／／ｇｗｙｘ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｅｄｇｅｏｇｒａｐｈｙ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
