链球菌检验作业指导书

1 主题内容与适用范围

本作业指导书规定了链球菌的检验方法。

本作业指导书适用于患者的生物样品（如：尿液、脓液、脑脊液、痰等）及医院物体表面涂抹样本及使用中消毒剂链球菌的检验。 2 引用标准

GB/T47.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 全国临床检验操作规程（第三版）

临床微生物学诊断与图解（第二版）周庭银编着 3 设备和材料 3.1 无菌棉拭子。

3.2 无菌5cm×5cm规格板。 3.3 温箱：36±1℃，42℃。 3.4 显微镜。

3.5 灭菌广口瓶：500mL。

3.6 灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。 3.7 灭菌吸管：10mL、1mL。 3.8 天菌平皿：90mm×15mm。

3.9 灭菌小试管：内径3mm，长5cm。 3.10 灭菌毛细管。

3.11 无菌注射器：5mL、10mL 3.12 橡皮乳头。 3.13 载玻片。 3.14 酒精灯。

3.15 灭菌金属匙或玻璃棒。 3.16 接种棒、镍铬丝。 3.17试管架、试管篓。 4 培养基和试剂

4.11%葡萄糖肉汤：按GB/T47.28中4.1规定。

4.2 血琼脂平板：按GB47.28中4.6规定。

4.3 SCDLP液体培养基：按卫生部《消毒技术规范》附录A.23中规定。 4.4麦康凯琼脂：按GB47.24中4.4规定。 4,56.5%氯化钠肉汤：见附录A1。

4.6马尿酸钠培养基：按GB/T47.28中3.9规定。 4.7 过氧化氢酶试验：按GB47.28中3.21规定。

4.8 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB47.28中3.13规定。 4.9 氨基酸脱羧酶试验培养基：按GB47.28中3.12规定。 4.10 糖发酵管：按GB47.28中3.2规定。 4.11 溶血性检查：见附录A1。

4.12 杆菌肽敏感试验：见附录A4。 4.13CAMP试验：见附录A5。 4.14胆汁-七叶苷试验：见附录A6 4.156.5%NaCl生长试验：见附录A7。 4.16Optochin敏感试验：见附录A3

4.17吡咯烷酮芳氨酶(PYRase)试验：见附录A9。

5 检验程序：见图1 图1：链球菌检验程序 食物中尿液、脓液、痰等 毒标本 1%葡涂血平板36℃±1℃ 萄糖肉片平板 汤增菌 18～24h 镜检

36℃±1℃18～24h

挑选具有α、β或γ溶血环的可疑菌落转种血琼脂平板分纯培养。 涂抹拭子、使用中的消毒剂用相应中和剂肉汤中和后取5mL 具有γ溶血环的菌落进行涂片染色镜检 36℃±1℃18～24h 具有β溶血环的菌落进行涂片染色镜检 具有α溶血环的菌落进行涂片染色镜检 触媒阴性，革兰氏阳性链状球菌 胆汁溶解试验、 6.5%NaCl肉汤生长试验 胆汁溶解（＋）、 6.5%NaCl肉汤 生长（－） 胆汁溶解（－）、 6.5%NaCl肉汤 生长（＋） 胆汁溶解（－）、 6.5%NaCl肉汤 生长（－） 非革兰氏阳性 链状排列球菌 排除链球

革兰氏阳性链状或单个排列球菌 触酶试 验阳性 触媒试 验阴性 触媒阴性、革兰氏阳性链状或单个排列球菌 γ链球菌一般对人不致病、必要时进行生化和血清学鉴定 进行生化和 肺炎链球菌 肠球菌属 杆菌肽敏感（＋）、 杆菌肽敏感（－）、 杆菌肽敏感、 血清学鉴定 CAMP均（－） 见表3、表4 CAMP（－） CAMP（＋） 进行生化和 A族溶血性 B族溶血性 血清学鉴定 6操作步骤链球菌 链球菌 6.1临床患者标本（如：尿液、脓液、痰等）可直接接种血平板置36℃±1℃18～24h进行分离培养，同时做涂片检查；对血液及脑脊液标本可以先用1%葡萄糖肉汤于36℃±1℃18～24h进行增菌培养，必要时置5%CO2环境中培养，然后用血琼脂平板进行分离培养。如无菌生长应连续培养7天，无论是否有菌生长均应再次转种血琼脂平板进行分离培养。

6.2涂片染色：链球菌为革兰阳性球菌，常链状排列，在琼脂平板培养基上涂片染色常呈短链或单个存在有时成对。

6.3医院物体表面涂抹拭子及使用中消毒剂用含有相应中和剂的肉汤中和后取5mL接种50mL1%葡萄糖肉汤于36℃±1℃18～24h进行增菌培养，然后用血平板进行分离培养。菌落形态如图1

6.4菌落特征：在血琼脂平板上36℃±1℃培养18～24h，菌落呈灰白色、半透明或不透明，比葡萄球菌菌落小，凸起或扁平（肺炎链球菌），用接种环刮取菌落时，常遇颗粒状不易乳化，不能均匀涂抹。菌落周围有三种溶血情况。

（1）α-溶血（草绿色）链球菌：菌落周围有灰绿色的狭窄α-溶血圈，红细胞不完全溶解，由于链球菌产生作用于血红蛋白毒素，在菌落周围出现绿色环。

（2）β-溶血（溶血性）链球菌：菌落周围有明显宽广的完全透明环，环内红细胞全部溶解。在厌氧培养更能准确地判定。

（3）γ-溶血（非溶血性）链球菌：菌落周围无任何改变。

杆菌肽敏感试验、 CAMP试验 6.5分离培养：

链球菌的属内鉴别，首先观察在血液琼脂平板上的溶血环，是β溶血、α溶血还是γ溶血，根据不同溶血类型进行鉴别。

6.5.1β-溶血链球菌的鉴定：β-溶血链球菌的鉴定，可检测特异性多糖抗原（链球菌群多糖抗原）来分群，采用商业性试剂盒，当前血清学诊断方法尚未普及之前，传统的对β-溶血链球菌的鉴定鉴别仍是需要的。A、B、C、G群细菌，一般可用杆菌肽、CAMP、PYR、VP、及β-D-葡萄糖苷酶（BGUR）等试验区别（表1）。

表1来自人类β-溶血链球菌的特性鉴别 菌种 Lancefield群抗原 菌落a PYR VPb CAMP BGUR※ 化脓性链球菌 A 大 ＋ － － NA 咽峡炎链球菌群b A 小 － ＋ ― NA 无乳链球菌 B 大 － NA ＋ NA 停乳链球菌马样亚种d C 小 － － － ＋ 咽峡炎链球菌群c C 小 － ＋ － － 咽峡炎链球菌群c F 大 － ＋ － NA

d

停乳链球菌马样亚种 G 小 － － － ＋

e

咽峡炎链球菌群 G 小 － ＋ － － 咽峡炎链球菌群f 未分群 － ＋ － NA

注：a：＋阳性；－阴性；NA，无资料；b,VP试验，无乳链球菌无意义；c曾命名S.mellcri或称米勒链球菌；d:最近资料提示来自人类β-溶血性含C、G群抗原菌落形菌株提议命名停乳链球菌马样亚种，在种水平上相关联。目前根据发酵海藻糖和山梨醇活性，区分其他含C群抗原菌种。※BGUR＝β-D-葡萄糖苷酶

表2来自人类和动物含LancefieldC、G群抗原的 β-溶血性小菌落形菌株的特征鉴别

菌种 Lancefield抗原 宿主 海藻糖 山梨醇

停乳链球菌马样亚种b C、G群 人类 ＋ － 停乳链球菌马样亚种b C、L 动物 ＋ － 马链球菌马亚种 C 动物 － － 马链球菌兽疫亚种 C 动物 － ＋ 狗链球菌 C 动物 － －

注：a，＋阳性；－，阴性；b，分离自人类停乳链球菌马样亚种，显示溶 解人纤维蛋白和链激酶活性，而来自动物的停乳链球菌马样亚种则缺乏上 述两种特性；可能出现例外；d.狗链球菌对BGUR是阴性，相反大多数

β-溶血含LancefieldC、G的抗原的大菌落链球菌是阳性。 6.5.2草绿色链球菌的鉴定：革兰氏阳性球菌，触酶阴性，草绿色溶血、胆汁溶菌阴性、Optochin阴性，不存在B、D群抗原，6.5%NaCl肉汤不生长，PYR阴性，10℃、45℃不生长、胆汁七叶苷阴性、万古霉素敏感。该类链球菌种类较多，首先推断性鉴定到群，参见表3、表4

表3草绿色链球菌的鉴定 菌群 变异链球菌 唾液链球菌 缓症链球菌 咽峡炎链球菌群 试验 甘露醇 ＋ － － －b 山梨醇 ＋ － － －b VP ＋ ＋ － ＋b 精氨酸 － － － － 七叶苷 ＋ ＋ － ＋ 尿酶 － ± － － a注：：a：＋.阳性反应；－.阴性反应；±.有些菌株阳性而另外菌株阴性；B：偶见例外。

表4缓症链球菌、咽峡炎链球菌、变异链球菌、唾液链球菌和牛链球菌的特性鉴别

缓症链球菌群 副 血 生 生 生 液 链 物 物 物 球 bbb1 2 3 菌 血液链球菌 － － － － － － V － V － － V － ＋ ＋ V ＋ ＋ ＋ NT ＋ ＋ － － － NT ＋ － － － V － ＋ － ＋ V ＋ V － ＋ ＋ V ＋ ＋ V NT ＋ ＋ － － － NT ＋ － － － ＋ － V － － ＋ － V － ＋ － － V ＋ － NT ＋ － － － － NT V ＋ － V ＋ ＋ V V ＋ ＋ V － － ＋ V － V ＋ V V ＋ V － － － V 戈 登 链 球 菌 － V － ＋ ＋ V ＋ － － V ＋ ＋ － ＋ － － ＋ ＋ － V ＋ ＋ － － － ＋ 嵴 链 球 菌 口 腔 链 球 菌 － ＋ ＋ － ＋ ＋ － － V V － － － ＋ V － － ＋ V V － V － － － V 缓 症 链 球 菌 － － V － － ＋ － － V V － － － ＋ ＋ － － V ＋ － － － － － － V 泛 口 腔 链 球 菌 － NT NT NT － NT － NT － － － － NT NT － － － ＋ － － － － － － NT V 婴 儿 链 球 菌 V NT NT NT V NT － NT － ＋ － V NT － － － ＋ － ＋ ＋ － － － － NT － 咽峡炎链球菌 咽 峡 炎 链 球 菌 － － － － － V ＋ V V V ＋ － － V V － ＋ ＋ V ＋ ＋ ＋ － － 星群链球菌 星咽群炎亚亚种 种 － － － － － ＋ － － － ＋ V － － V － － ＋ V V ＋V ＋ － V ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － V 试验 变异链球菌 中变 表间异 兄链链 链球球 球菌 菌 菌 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ V － － ＋ V － － ＋ － － ＋ ＋ V ＋ ＋ ＋ － ＋ － － － － － ＋ ＋ － V ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ V ＋ ＋ － V ＋ － － － － － － － ＋ － － － ＋ － － ＋ － － V － ＋ － － － ＋ － － 唾液链球菌 唾前液庭牛链链链球菌 球球菌 菌 V － － － － V V ＋ － ＋ V V － V V － ＋ ＋ － － ＋ ＋V － － － － － － V － ＋ － ＋ V － － V － － V V － － V － ＋ － NA NA NA NA － NA ＋ NA V －vd V ＋ － ＋d＋ ＋ － V ＋ ＋ － ＋ ＋ － － 酶活性 β-D-岩藻糖苷酶 β-D-乙烯半乳糖苷酶 唾液酸苷酶 α-L岩藻糖苷酶 β-D乙酰葡糖苷酶 α-D葡萄糖苷酶 β-D葡萄糖苷酶 α-阿拉伯糖苷酶 α-D半乳糖苷酶 β-D半乳糖苷酶 苦杏仁苷（产酸） 菊糖 甘露醇 N-乙酰葡糖胺 棉子糖 山梨醇 熊果甙 乳糖 蜜二糖 塔格糖 精氨酸（水解） 七叶苷 3-羟基丁酮 尿素 透明质酸酶 碱性磷酸酶 － ＋ － ＋ ＋ － － － － V － － － ＋ － － ＋ V － V V － － － － － 注：＋.阳性；－.阴性；V.不定；NT.未做试验；NA.无资料；b.参考Beighton等生物型。C.阳性菌株的百分比可能不定，取代于应用正确试验。d.试验结果有怀疑为“变异菌株”，变异菌株亦是对葡萄糖苷酶“变异”，不产生细胞外酶。

6.5.3与链球菌属相关菌属的鉴别

6.5.3.1乳球菌属：原链球菌属中乳链球菌现成为乳球菌属。乳酸球菌（L.lactis）和乳脂球菌（L.cremoris）在制奶酪和粮食工业生产中使用。临床标本（血液、尿、眼、人工瓣膜心内膜炎）中也常见到。该属菌种与肠球菌相似，唯一不同点是45℃不生长。

6.5.3.2孪生球菌属：原麻疹链球菌（S.morbillorum）现转入孪生球菌属，另一种是溶血孪生球菌（G.haemolysans）。该属菌种曾从临床标本中检到，见于临床感染如心内膜炎。其特点是生长缓慢，可能被误认为营养缺陷链球菌，应用“卫星现象”试验区别开来。菌种鉴定参照表5 表5孪生球菌属菌种鉴定 菌种 试验 革兰染色菌 PYR 甘露醇 山梨醇 细胞排列 溶血孪生球菌 ＋ － － 成双，四联，成族 ww麻疹孪生球菌 ＋ ＋ ＋w 成对。短链 w注：＋，阳性；－，阴性；＋，弱阳性反应。

6.5.3.3片球菌属：该属菌种对万古霉素，PYR阴性，发酵葡萄糖不产气，胆汁七叶苷、精氨酸阳性，含有D群抗原，不发酵乳糖，在含盐肉汤中生长缓慢，属内鉴别见表6。乳酸片球菌（P.acidilactici）和戊糖片球菌（P.pentosaceus）曾从临床标本中分离到。

附录A

A1触酶试验(过氧化氢酶试验) 原理：

触酶

2H2O22H2O+O2

试剂：3%H2O2溶液，置棕色瓶内于4℃C阴暗处保存。

方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢1～2滴。静置，1min内产生大量气泡为阳性，不产生气泡为阴性。

附注：

1.过氧化氢为3%，应用30%浓的H2O2，用时稀释10倍。放置时间较久的30%浓的H2O2使用时应重新测定浓度，以实际浓度进行稀释。

2.不应在培养基上做试验。挑取菌落时不可刮到培养基。 3.每次试验时，应以阳性和阴性菌株做对照。 A2溶血性检查

溶血性是鉴定链球菌最常用的项目，也是鉴定过程中重要的一步。 材料:羊血琼脂平板。

方法:将标本接种于手血平板t，用接种针在已接种过的血平板上扎2-3处，使细菌被接种到琼脂层深处，35℃孵育过夜。

观察结果:在接种针穿刺过处，羊红细胞完全榕解，形成无色透明区，为β-溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环，为α-溶血。不溶解无溶血环为γ-溶血。

注意点:甲型溶血链球菌与A群链球菌不是同一概念，前者是指细菌生长血琼脂平板上对羊血球溶血性试验，而后者是指根据Lancefield血清学分群。

A3Optochin敏感试验

材料:Optochin(乙基氧化羟基奎宁EthylhydrocupreineHCL)纸片(直径6mm)，每片5μg；血琼脂平板。 方法:挑取被检菌落，涂在血平板上，贴Optochin纸片于接种处，35℃，烛缸孵育18h。 观察结果:抑菌环直径>14mm为敏感，推断为肺炎链球雨。 抑菌环直径<14mm时参照胆汁溶菌，或为其他草绿色链球菌。 A4杆菌肽敏感试验

材料:每片含0.04U的杆菌肤纸片，血琼脂平板。

方法:挑取被检菌落，密涂于血琼脂平板上，接种量应大，以免出现假阳性。贴上杆菌肤纸片，35℃过夜。

观察结果:形成抑菌环为敏感，则推断被检菌为A群链球菌。 A5CAMP试验

材料:血平板，金黄色葡萄球菌ATCC25923。

方法:在血平板上，用金黄色葡萄球菌划种4条直线，再将被检菌距金黄色葡萄球菌接种线3mm处呈直角接种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌。35\"c孵育过夜。

观察结果：在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个矢形(半月形)加强溶溶区，此即CAMP试验阳性，否则为阴性。

A6胆汁-七叶苷试验

培养基：牛肉膏3g七叶苷1g蛋白胨5g 枸橼酸铁0.5g胆盐10g蒸馏水1000mL

将各成分溶于蒸馏水中调pH至7.2～7.4。分装试管，每管3mL于108℃20min灭菌备用。 方法：接种被检菌1～3个菌落，置36℃培养24～48h。

观察结果：生长并使培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。 A76.5%NaCl生长试验

培养基：NaCl6.5g蛋白胨1g牛肉膏0.3g 葡萄糖0.1g蒸馏水100mL

调pH至7.4分装小试管，每管2～3mL高压蒸汽121℃15min灭菌后备用。

方法：接种被检菌，36℃培养过夜，培养基混浊有菌生长为阳性，接种菌应注意不可接种量过多使培养基未经培养液即显混浊，出现假阳性。

A8色素试验

色素试验在鉴定B群链球菌的方法中，特异性最好，是Noble改良的Islam法。 培养基：水溶性淀粉5g胨（3号月示胨）23g

NaH2PO41.48gNa2HPO45.75g 琼脂10g水1000mL

调整pH7.4，高压蒸汽121℃15min灭菌后冷至55℃，加入50mL灭菌马血清，倾制平板或高层琼脂。接种细菌，36℃用厌氧气袋培养。

观察结果：B群链球菌形成橙色菌落及周围的培养基呈黄色为阳性，该法阳性率可达93%～97,7% A9吡咯烷酮芳氨酶(PYRase)试验

原理:细菌产生毗咯烷酮酰肽酶、水解L-吡咯烷酮β-荼酚酰胺(PYR)基质，释放β-萘酚酰胺与试剂N,N-二甲氨基肉桂醛反应，产生桃红色为阳性。

目前测定PYR试验和LAP试验用纸片法，有商品供应，具体操作参号各厂家说明书。 A10胆汁溶菌试验

用10%脱氧胆酸钠溶液直接滴加在可疑菌落上，置36℃孵箱内15～30min后观察被检菌是否已溶解，注意，有时被检菌被试剂冲走移位。