包括标本采集和增菌、免疫磁珠富集和培养、生化反应、血清学和毒力因子鉴定等步骤。
1．粪便标本增菌
1) 采集的标本应插入卡里－布莱尔半固体保存培养基中，立即送实验室接种于
增菌培养基（EC肉汤+10mg/L新生霉素或Tryptic Soy Broth）；
2) 增菌培养：增菌液可用添加10mg/L新生霉素的EC肉汤。也可用1/8N 的
HCl+0.5%NaCl溶液，将标本处理30秒后，再用胰大豆胨培养液增菌。
2．免疫磁珠富集方法
1) 取下磁板，然后将事先编号的1.5ml离心管置于Dynal MPC－M架上； 2) 重新悬浮E.coli O157的DynaL磁珠,直到底部的沉淀消失。吸取抗E.coli
O157磁珠， 每管20ul；
3) 取1ml增菌培养物的标本, 加入管中，然后盖紧管，每加一个样品,都要换
新管；
4) 颠倒Dyna架几次, 然后在室温条件下, 置于 Dynal MX3样品混合器上,不断
轻轻搅动,以阻止磁珠沉淀,持续时间10分钟（如果没有混合器， 可人工混合）；
5) 将磁板插入到Dynal MPC－M上颠倒支架数次，以浓缩磁珠沉淀到管壁，作
用持续3分钟；
6) 用配套的开盖器打开试管，小心的吸取悬浮液（包括残留在管盖上的液体），
并弃掉（请检查影响产物出现的因素）；
7) 将磁板从Dynal架取下；
8) 加入1ml洗涤缓冲液（PBS—吐温），吸管不要接触小离心管，以免造成样品
及缓冲液的交叉污染；然后盖上盖，将Dynal MPC－M架颠倒数次，以重新悬浮磁珠； 9) 重复5－8的步骤； 10) 重复5－7的步骤；
11) 用100微升冲洗缓冲液（PBS－吐温）重新悬浮磁珠细菌混合物。用一个混
合器做短暂的混匀。此为富集的肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌悬液； 12) 将上述菌悬液划线接种于CT－山梨醇麦康凯（C－头孢菌素类抗生素、T－亚
碲酸钾）等选择性培养基上，370C培养16～24小时。
3．生化反应、血清学和毒力因子鉴定
1) 生化反应鉴定：将疑似肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌落进生化反应。若
生化反应特点符合大肠杆菌的鉴定标准，进行血清学鉴定。
2) 血清学鉴定：使用O157和H7特异性抗体，使用玻片凝集方法进行鉴定。血
清学鉴定为O157：H7、O157：H-的菌株， 进行毒力因子鉴定。
3) 毒力因子鉴定：包括对EHEC特异性溶血素 基因、志贺毒素1、志贺毒素2、
志贺毒素1和2 的变种、EHEC特异性的eae基因的检测。可使用PCR方法进行。 所使用的引物，必须是国内或国际公认的、已经发表的引物。在使用PCR方法进行鉴定时，在同一次PCR试验中， 必须同时包括阳性对照和阴性对照。只有在阳性对照和阴性对照的PCR试验经过分别是阳性和阴性时， 所检测标本的试验结果才具有诊断意义。
肠出血性大肠杆菌O157：H7的检验程序
粪便或其它标本
增菌6小时左右
磁珠浓缩
山梨醇—麦康开 培养基培养18-24小时
可疑菌落
革兰氏 生化 血清学 毒力因子 染色 反应 鉴定 鉴定*
根据结果判定
* 有条件的单位可进行，如用PCR检测SLT1 、SLT2、Hly、EAE的基因
【注】
1) 培养及增菌均在37℃进行。
2) 山梨醇-麦康凯培养基中应加入适当的抑菌剂。
3) “科玛嘉”培养基加入亚碲酸钾后选择效果更好。
4) 在SMAC中加入下列抑制剂的一种均可增加培养基的选择性。
a) 亚碲酸钾2.5mg/l 和先锋霉素类抗生素Cefixime 0.05mg/l； b) 新生霉素10mg/l； c) 万古霉素40mg/l；
5) 在科玛嘉或S--MAC平板上挑选可疑菌落与O157诊断血清、H7血清或O157
单克隆抗体作试探性凝集试验，若不凝集，但临床表现疑为EHEC感染，则应做如下处理。因为个别肠出血性大肠杆菌O157：H7具有K抗原，应在生化反应确定为大肠杆菌后用生理盐水制备菌悬液，并100℃水浴加热10-15分钟再与O157诊断血清或O157单克隆抗体做凝集试验。
6) 当生化反应和血清学反应结果均与肠出血性大肠杆菌O157：H7符合时，才
能确认为肠出血性大肠杆菌O157：H7。
7) 目前许多国家使用的O157和H7特异性抗体与及少数细菌具有不同程度的交
叉反应，如美国、法国还有我国自己生产的试剂都与弗劳地枸橼酸杆菌有交叉反应，因此，用生化试验确定为大肠杆菌是必须的,最为重要的是硫化氢试验。绝大多数肠出血性大肠杆菌菌株在24小时内不的发酵D-山梨醇。 但是，也报道了一些能够快速发酵D-山梨醇的菌株。 8) 典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：
a) 动力试验 葡萄糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 硫化氢 尿素试验
+ + + + +/－ － －
b) 靛基质 甲基红 V-P试验 枸橼酸盐 苯丙氨酸脱氨酶
+ + － － －
c) 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 氧化酶 氰化钾
+/－ +/－ － －
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