(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110592088 A(43)申请公布日 2019.12.20
(21)申请号 201910930633.5(22)申请日 2019.09.29
(71)申请人 山东如戴生物科技有限公司
地址 250000 山东省济南市高新区新宇路
750号3号楼3单元201D(72)发明人 王青 朱静 (51)Int.Cl.
C12N 15/113(2010.01)C12N 5/10(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页
(54)发明名称
一种促进干细胞增殖的miRNA及其细胞模型(57)摘要
本发明提供一种miR-127-3p在提高干细胞增殖中的用途，特别是将miR-127-3p导入到人脐带间充质干细胞中可以显著的提高该细胞的增殖效果，为研究该细胞模型的应用，提供了有益改进。
CN 110592088 ACN 110592088 A
权 利 要 求 书
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1.一种miR-127-3p，其核苷酸序列为ucggauccgu cugagcuugg cu。2.miR-127-3p在促进人脐带间充质干细胞增殖中的用途。
3.如下1)至3)中任一物质在制备促进人脐带间充质干细胞增殖中的用途：l)miR-127-3p；
2)含有miR-127-3p的编码基因的重组载体；3)含有miR-127-3p的编码基因的重组病毒。4.如权利要求2或3所述的用途，其中所述miR-127-3p的核苷酸序列为ucggauccgu cugagcuugg cu。
5.含有miR-127-3p的编码基因的重组载体。6.含有miR-127-3p的编码基因的重组病毒。7.一种细胞模型，其是将miR-127-3p、含有miR-127-3p的编码基因的重组载体或含有miR-127-3p的编码基因导入至人脐带间充质干细胞中得到的细胞模型。
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说 明 书
一种促进干细胞增殖的miRNA及其细胞模型
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技术领域
[0001]本发明属于生物领域，具体涉及一种促进干细胞增殖的miRNA及培养基。
背景技术
[0002]成熟的miRNA属于内源性的非编码RNA家族，长度为19-25nt，主要在转录后水平对基因表达起负调控作用。近年来miRNA的研究进展迅速，目前已在人类基因组中发现了700余种miRNAs，并且据估计有超过1000种miRNAs可能存在。许多miRNAs基因序列和分布高度保守，显示其具有重要的生物学功能，现有研究显示miRNAs对干细胞增殖和分化有一定的调控作用。
[0003]miRNAs广泛分布于哺乳动物基因组中，既可位于基因间也可位于基因内。miRNAs可作为独立的转录单位，也可作为其他转录单位的一部分共同转录，还有一些miRNA基因是成簇分布在染色体上，它们通过一个共同的启动子转录成为多顺反子，由RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ转录。miRNAs的成熟过程包括核内和胞内两步。miRNA基因的初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核内被RNaseⅢ核酸酶Drosha和RNA结合蛋白DGCR8组成的复合物加工成长约70nt的发夹状pre-miRNA，pre-miRNA在Exportin5和Ran-GTP的帮助下从细胞核进入细胞质内。胞质中pre-miRNA在Dicer酶的作用下，被切割成双链RNA分子，然后成熟的miRNA分子被解链，单链的miRNA与RISC复合体结合，另一条被释放降解。miRNA通过其5’端的8个核苷酸序列(seed sequence)与靶基因的3’非翻译区(UTR)互补配对，指导RISC对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制。
[0004]miRNAs在哺乳动物不同组织和细胞中的表达情况不同，一些是细胞特异性的，而另外一些是较普遍存在的。在鼠胚干细胞中约有110000个miRNAs转录本，300多种miRNAs，然而绝大多数种类的miRNAs表达水平相对较低。在未分化的胚胎干细胞中，仅有少数几种miRNAs高表达，鼠胚干细胞中为miR-292和miR-302家族，人胚干细胞中为miR-371和miR-302家族。许多胚胎干细胞特异性的miRNAs是作为多顺反子共同转录，显示其受共同上游序列调控并具有协同表达的模式。胚胎干细胞特异性的miRNAs还具有相同或相似的有共同的mRNAs靶序列。未分化的胚胎干细胞miRNAs表达谱与分化成熟的体细胞存在明显差异，在胚胎干细胞中高表达的miRNAs在体细胞内不表达或低表达，而广泛表达于体细胞的miRNAs，如let-7家族在胚胎干细胞中表达极低。综上所述，胚胎干细胞特异性的miRNAs可能在维持干细胞多能性和自我更新能力方面具有重要作用，是胚胎干细胞的重要标志物之一。[0005]miRNAs通路的破坏导致胚胎干细胞增殖和分化方面的缺陷：Dicer酶和RNA结合蛋白Dgcr8在miRNAs的成熟过程中起关键作用。为研究miRNAs在胚胎干细胞发育方面总的作用，研究者通过使用Dicer1和Dgcr8敲除模型来破坏miRNAs的成熟过程，使miRNAs表达下调。结果发现，在Dicer1敲除的模型中，小鼠在胚胎发育的早期阶段死亡。Dicer1缺失的鼠胚干细胞在增殖和分化方面都出现缺陷，G1和G0期延长，甚至在诱导分化的条件下也不表达分化标志物，如内胚层标记物HNF4A和中胚层标记物BMP4等，而仍表达胚胎干细胞多能性标志物OCT4。在Dgcr8敲除的小鼠模型中，胚胎干细胞也出现G1期的阻滞，在明确的分化条
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说 明 书
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件下，Dgcr8缺失的胚胎干细胞不能下调干细胞多能性标志物OCT4和Nanog的表达，仍具有产生胚胎干细胞克隆的能力。Dicer敲除的人胚干细胞细胞与野生型的人胚干细胞相比，增殖速度减慢，G1和G2期的细胞数量增多而S期的细胞数量减少，干细胞特异性标志物的表达上调，在增殖和分化方面出现障碍。由此可见，miRNAs在胚胎干细的增殖和分化方面起重要的调控作用。
[0006]与体细胞相比，胚胎干细胞细胞周期的特点是G1期很短，以适应早期胚胎发育期间的快速生长。缺失Dicer1或Dgcr8的胚胎干细胞增殖速度减慢，处于G1期的细胞增多，这说明miRNA在胚胎干细胞的细胞周期调控中起重要作用。Blelloch等将不同种类的miRNAs分别导入Dgcr8敲除的胚胎干细胞中，然后观察处理后的Dgcr8缺失胚胎干细胞能否快速通过G1/S限制点。结果发现，14种miRNAs可以不同程度地恢复突变胚胎干细胞快速增殖的能力，其中miR-291、miR-294及miR-295可以单独完全弥补突变胚胎干细胞G1/S限制点通过缺陷。此研究亦发现，这些miRNAs具有相同的“seedsequence”，提示其具有相同mRNA作用位点。Card等的研究发现，多能性因子Oct4/Sox2结合在miR-302的启动子上，可以上调miR-302的表达，miR-302可直接作用于细胞周期调控蛋白CyclinD1和D2，过表达miR-302可使S期延长，G1期缩短。另有研究发现，miR-92b可抑制细胞周期抑制因子p57的翻译，促进胚胎干细胞迅速通过G1/S限制点。综上所述，干细胞特异性miRNAs可促进干细胞通过G1/S限制点，保持其快速增殖的特性。miRNAs通路调控胚胎干细胞的分化：胚胎干细胞另一重要特性是在一定条件下可分化为多种功能细胞。miRNAs缺失的胚胎干细胞在细胞增殖和细胞分化上都存在缺陷，说明miRNAs通路对干细胞的分化也起重要作用。[0007]Let-7miRNA广泛分布于已分化组织中，在干细胞的分化过程中发挥重要作用。研究表明，将Let-7导入Dgcr8缺失胚胎干细胞后，突变的胚胎干细胞可恢复在特定条件下分化的能力；Let-7的靶mRNA包括了c-myc、sal14和lin28，这些基因与干细胞保持未分化状态密切相关。某些miRNAs的靶序列是胚胎干细胞多能性标志物mRNA，如miR-134、miR-296和miR-470的靶mRNA为Nanog、Oct4和Sox2；miR-145的靶mRNA为OCT4、SOX2和KLF4。这些miRNAs可降低胚胎干细胞多能性标志物的表达，促进干细胞的分化。[0008]miRNAs对胚胎干细胞的增殖和定向分化也起重要作用。miR-9可促进胚胎干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，miR-1和miR-133可促进胚胎干细胞增殖和向中胚层方向分化。不同的miRNAs通路对胚胎干细胞的增殖和分化起不同的作用，在一定程度上，miRNAs决定了干细胞的命运。miRNAs与体细胞重编程为iPS细胞：诱导多能干细胞是利用病毒载体将4个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。但目前诱导体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率极低，提高诱导多能干细胞诱导效率是亟待解决的一个难题。Judson等将干细胞特异性的miRNAs与Oct4，Sox2，Klf4共同转染成纤维细胞，结果发现干细胞特异性的miRNAs提高了重编程的效率，尤其是miR-294将诱导多能干细胞的诱导效率由0.01％-0.05％提高到0.4％-0.7％。Melton等发现抑制组织特异性let-7的表达可提高体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。综上所述，miRNAs在体细胞被诱导为诱导多能干细胞的增殖过程中起重要作用。
[0009]CN104800860A中公开了miR-17-92基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用；所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，神经细胞的数量会相应提升，进而促进神经细胞的增殖；提高miR-17-92基因簇的表达量后，新生神经元数量增加，进而促进
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说 明 书
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神经再生。
[0010]发明人在前期研究中发现microRNA26b－5p能够靶向下调p300对人脐带间充质干细胞的增殖作用，但是随着干细胞应用的增加，对于高细胞增殖培养变得越来越重要，虽然现有技术中对于干细胞增殖的研究也较为多，但是如何快速培养、增殖干细胞仍然是本领域较为重要的研究课题。
发明内容
[0011]本发明在前述的基础上，继续研究，发现了miR-127-3p具有促进干细胞增殖的效果。
[0012]基于上述目的本发明提供了如下1)至3)中任一物质在制备促进干细胞增殖的培养基中的用途：
[0013]l)miR-127-3p；
[0014]2)含有miR-127-3p的编码基因的重组载体；[0015]3)含有miR-127-3p的编码基因的重组病毒。[0016]优选地，所述miR-127-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，ucggauccgucugagcuugg cu。
[0017]所述的miR-127-3p的前体具有如下结构(SEQ ID N0:2):
[0018]5'UGUGAUCACUGUCUCCAGCCUGCUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUUCAGAAAGAUCAUCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCUGCGGAACUCAUCAUC3，。[0019]miR-127-3p mimic序列：5'-UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU-3'，由上海生工合成。[0020]可选地，所述干细胞为人脐带间充质干细胞。[0021]可选的，所述培养基为干细胞培养基。[0022]更进一步的，所述干细胞培养基为：B27(2％)、表皮生长因子(20ng/mL)、碱性成纤维细胞生长因子(20ng/mL)、胰岛素(5mg/mL)、双抗(100IU/mL)的DMEM/F12培养基。[0023]更进一步的，所述干细胞培养基为StemFlex培养基。[0024]更进一步的，所述干细胞培养基为Essential 8培养基。[0025]本发明另外提供含有miR-127-3p的编码基因的重组载体；[0026]本发明另外提供含有miR-127-3p的编码基因的重组病毒。[0027]本发明还提供了一种重组细胞，其是将miR-127-3p、含有miR-127-3p的编码基因的重组载体或含有miR-127-3p的编码基因导入至出发细胞中得到的重组细胞。[0028]有益效果
[0029]本发明提供一种miR-127-3p在提高干细胞增殖中的用途，特别是将miR-127-3p导入到人脐带间充质干细胞中可以显著的提高该细胞的增殖效果，为研究该细胞模型的应用，提供了有益改进。附图说明
[0030]图1为细胞OD图。
[0031]图2为细胞培养密度图。
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具体实施方式
[0032]本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。
[0033]人脐带间充质干细胞，产品货号:HUXUC-01001，购买自赛业生物科技有限公司。[0034]实施例1miR-127-3p转染人脐带间充质干细胞[0035]实验分为两组：空白对照组(PBS)、miR-127-3p转染组(转染miR-127-3pmimic)。培养人脐带间充质干细胞在指对数生长期时铺于6孔板中，1d后进行转染。每孔取37℃预热无血清DMEM/F12培养基稀释mimic后加Lipofectamine 2000转染试剂。将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养48h后用于进一步实验。[0036]先前实验阶段已经确定miRNA mimic最佳用量6孔板为5μL(20μmol/L)，分别于24、48和72h观察转染效率，发现24h转染率较低，48h转染效率最高，72h时可能由于荧光部分发生淬灭，转染效率比48h略有下降。48h时miR-127-3p转染组细胞转染效率为(58.73±5.05)％。
[0037]实施例2阳性转染细胞的筛选及PCR鉴定[0038]通过流式细胞技术筛选阳性转染细胞，所述细胞并采用如下PCR鉴定，实时定量PCR检测：以人脐带间充质干细胞为对照，使用Trizol法提取上述空白对照组和转染组干细胞总RNA，用紫外分光光度计测量RNA的纯度和浓度。选用OD260/0D280比值为1.8-2.2的RNA进行逆转录，其余存于-80℃冰箱备用。[0039]制备逆转录混合反应液，加入总RNA和所有试剂后在PCR扩增仪中进行逆转录反应，反应条件为Poly(A)加尾和反转录反应：37℃60min；85℃5s。以其产物cDNA为模板，每组样本设3个复孔，以U6为内参，分别用miR-下表的引物(表1)：[0040]表1实时定量PCR引物序列
[0041]
Forward primer(5’-3’)Reverse primer(5’-3’)miR-127-3pTCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT U6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT
[0042]进行实时PCR反应。反应条件：95℃10s；95℃5s，60℃20s，共40个循环。后进行实时PCR反应，以GAPDH为内参，反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40个循环。[0043]结果显示，miR-127-3p转染组较空白对照组的miRNA表达量上升，差异有统计学意义(*表示P<0.05),见表2。
[0044]
[0045]
miR-127-3pPBS空白对照1.03±0.07miR转染组5.63±0.12*結果表明，转染了miR-127-3p的人脐带间充质干细胞其miR-127-3p得到了高表
达。
实施例3MTT法检测miR-127-3p对人脐带间充质干细胞增殖能力的影响
[0047]收集空白对照转染的人脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为1×105/mL。实验组每组有3个复孔。分别向6块96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，37℃、5％CO2培养过夜24h后，同时留有1组不加细胞只加培养基作为校正。分别于6、12、24、48、72、96h取出1块孔板，向每孔加入50μLMTT溶液，再孵育4h后小心吸去上清，向每孔加入150μL二甲基亚砜，置于摇床上
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[0046]
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说 明 书
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低速振荡10min。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测量各孔的吸光值，以空白培养基调零，取各组平行孔平均OD值，绘制各组细胞的生长曲线。[0048]MTT实验显示：从图1可以看出，转染组与对照相比，48h后，细胞增殖开始明显增加(P<0.05)，96h后OD达到2.56，比对照的0.9显著的增加。这也说明转染组的细胞增殖速度得到了明显的提高。图2也可以看出，96h后相同取样条件下转染组的细胞密度得到了显著的提高。
[0049]应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
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序 列 表
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序列表<110> 山东如戴生物科技有限公司<120> 一种促进干细胞增殖的miRNA及其细胞模型<160> 2<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 22<212> RNA<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum<400> 1ucggauccgu cugagcuugg cu 22<210> 2<211> 93<212> RNA<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum<400> 2ugugaucacu gucuccagcc ugcugaagcu cagagggcuc ugauucagaa agaucaucgg 60auccgucuga gcuuggcugc ggaacucauc auc 93
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说 明 书 附 图
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