维普资讯 http://www.cqvip.com 一８一 江苏农业科学２００６年第４期 水稻ＴＡＣ基因组文库的筛选与克隆转化 周玲艳 ，姜大刚 ，庄楚雄 （１．仲恺农业技术学院生命科学学院，广东广州５１０２２５；２．华南农业大学生命科学学院，广东广州５１０６４２） 摘要：利用一个ｃＤＮＡ片段筛选了水稻品种台中６５ ＴＡＣ２７基因组文库，获得一个阳性克隆，将该阳性克隆 转化水稻温敏核不育材料７００１Ｓ并获得转化苗，转化苗经ＰＣＲ检测，证实外源基因已整合到水稻基因组中。 关键词：水稻；基因组文库；阳性克隆；转化 中图分类号：￥５１１．０３５．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２００６）０４—０００８—０３ 基因组文库是进行分子克隆与基因组结构及功 室苏菁构建。筛选基因组文库用的ｃＤＮＡ片段由华 能研究的基础，构建基因组文库并进行筛选是克隆 南农业大学生命科学学院庄楚雄提供。 完整基因的经典方法。植物遗传转化技术不仅是遗 １．．１．２ 载体和菌株 质粒载体为ｐＹＬＴＡＣ２７ 传改良的重要手段，而且是研究基因和基因组功能 （图１）（华南农业大学遗传工程实验室刘耀光提 必不可少的技术，通常从不同途径克隆出的基因都 供），该质粒载体既可用于基因克隆，又可直接用于 须通过转化来验证或进行功能测定。应用于基因组 植物遗传转化，筛选标记基因为ｈｅｒ基因。农杆菌 文库构建的载体系统主要有ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＢＩ－ 菌株为ＬＢＡ４４０４。 ＢＡＣ和ＴＡＣ等。ＴＡＣ载体系统是在结合ＰＡＣ载体 １．１．３ ＰＣＲ扩增引物 基因： 和双元载体优点的基础上建立起来的…，它含有Ｐ１ ５ 一ＧＴＣＣＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＴｒＧＧＡＧ一３ 质粒和Ｒｉ质粒的复制子，能在农杆菌和大肠杆菌穿 ５ 一ＧＴＣＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧ一３ 梭，而且既可用于基因克隆，又可直接用于植物遗传 １．１．４植物培养基培养基参照文献［７］。 转化，省去了亚克隆的步骤。应用ＴＡＣ载体已构建 了拟南芥…、小麦 Ｊ、水稻 等基因组文库，并应用 ＴＡＣ载体已经成功克隆了多个拟南芥基因－ｌ，４ ］及 花发育相关基因 Ｊ。ＴＡＣ载体系统已包括ＴＡＣ７、 ＴＡＣ１７、ＴＡＣ２７、ＴＡＣ７４７等，以适于不同植物材料和 目的使用。本研究筛选水稻温敏核不育系的恢复系 台中６５ ＴＡＣ２７基因组文库，获得的阳性克隆转化水 稻，建立了混合基因组文库的筛选方法以及成功建 立了ＴＡＣ２７的转化系统。 注：Ｐ１复制子和ｍ复制子分别使ＴＡＣ质粒在大肠杆菌 和农杆菌中进行复制；Ｐ１复制子可在ＩＰＴＧ诱导下增加质粒拷 贝数而提高质粒产量；ｓａｃＢ是大肠杆菌启动子驱动下的蔗糖 １材料与方法 诱导致死基因。 １．１材料 １．２ 方法 １．１．１ 基因组文库和筛选文库探针 台中６５ １．２．１基因组文库的筛选 ＴＡＣ２７基因组文库由华南农业大学遗传工程实验 １．２．１．１高密度膜的制备用３８４孔针将ＴＡＣ２７ 收稿Ｅｔ期：２００６—０３—０２ 文库３８４孔板上的混合克隆点印在一张Ｈｙｂｏｎｄ— 基金项目：国家“８６３”计划项目（编号：２００２ＡＡ２２４１２１）；国家自然科 Ｎ 膜上。为了避免假阳性，在进行基因组文库转膜 学基金资助项目（编号：３００８００１９）。 时，每一块３８４孔板在膜上呈对角方向点两个重复， 作者简介：周玲艳（１９７２一），女，湖南衡阳人，硕士，讲师，主要从事 实验中采用３×３列阵点膜。将点印好的膜放在含 水稻遗传与生物技术研究。Ｔｅｌ：（０２０）３１５１７２７８；Ｅ—ｍａｉｌ： ２５ ｍｌ Ｋａｎ和０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ的固体ＬＢ方板 ｌｉｎｇｙａｎｚｈ＠１６３．ｔｏｍ。 上，３７℃培养过夜。将膜取出，置于已用５％ＳＤＳ、 维普资讯 http://www.cqvip.com 周玲艳等：水稻ＴＡＣ基因组文库的筛选与克隆转化 ・－－——９・－－—— ０．２ Ｘ ＳＳＣ溶液浸湿的滤纸上处理５ ｍｉｎ，使菌体裂 解，用微波炉烘烤３～４ ｒａｉｎ至膜完全烘干，使ＤＮＡ 变性并完全固定于尼龙膜上。再用煮沸的洗液将膜 漂洗干净，并用微波炉烘干高密度膜，保存备用。 １．２．１．２文库筛选分两次杂交筛选，第一次是筛 选台中６５ ＴＡＣ２７混合基因组文库。然后根据第一 轮杂交的结果，在文库中取与杂交阳性克隆对应孔 的克隆进行不同倍数的稀释，并涂ＬＢ平板（含Ｋａｎ 将第二次筛选得到的阳性克隆进行培养、抽提 质粒ＤＮＡ、历柑Ⅲ酶切、电泳，结果表明筛选台中 ６５ ＴＡＣ２７的ｌ６个阳性克隆为同一克隆（图４）。将 酶切ＤＮＡ转膜，用筛选基因组文库回收的探针进行 杂交，结果表明克隆均有相同的杂交带（图５），从而 进一步证实了酶切分类结果的正确性。 １２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７ｌ８１９∞２１２２２３ ２５￣ｇ／ｎａ），经３７℃培养１５ ｈ后，挑取单克隆于无 菌且加有ＬＢ液体培养基的３８４孔板中，３７ ｏ【＝培养８ ｈ左右，进行杂交膜的制备。制备的杂交膜用第一 次杂交回收的探针进行第二轮筛选。 １．２．１．３ 阳性克隆的分类、鉴定将第二次筛选得 到的阳性克隆进行培养、抽提质粒ＤＮＡ，用ＨｉｎｄｌｉＴ 酶切，并进行Ｓｏｕｔｈｅｎｒ Ｂｌｏｔ鉴定。 １．２．２阳性克隆转化水稻 １．２．２．１愈伤组织的浸染及共培养挑选颜色新 鲜、淡黄色、致密、生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织， 将愈伤组织和农杆菌菌液按一定的比例混合，浸染 ２０ ｍｉｎ，期间摇动几次。取出愈伤组织，并用灭菌的 滤纸吸去多余的菌液。将愈伤组织接到加有一张滤 纸的共培养培养基上，２６℃下暗培养２～３ ｄ。 １．２．２．２抗性愈伤组织的筛选、预分化及分化将 共培养后的愈伤组织取出放在有３层滤纸的灭菌培 养皿中干燥２～３ ｄ，经干燥处理过的愈伤组织接人 含合适筛选压的筛选培养基上，筛选２次，每次２～ ３周。挑选生长状态好的抗性愈伤组织接人预分化 培养基上，２６ ｏ【＝，光照培养３周，再将新的抗性愈伤 组织接人分化培养基上分化成苗。 １．２．２．３ 转化苗的ＰＣＲ检测 抽提转化植株 ＤＮＡ，进行Ｈｙｇ基因的ＰＣＲ扩增。 ●２结果 ’‘ ， ２．１ 基因组文库的筛选与鉴定 ２．１．１ 基因组文库的筛选 以ｅＤＮＡ片段Ｐ４７为 探针，筛选粳稻品种台中６５ ＴＡＣ２７基因组混合文库 获得一个阳性克隆，编号为０７Ｎ１４（图２）。将第一 次筛选得到的阳性克隆取少量菌液进行一定倍数的 稀释，分别涂３～４个ＬＢ平板（含Ｋａｎ ２５ ｔｘｇ／ｍ１）， 然后挑单菌落于３８４孔板中，共挑２块３８４孔板，按 前面的点膜方式进行转膜，以第一次筛库的标记探 针进行第二次杂交。结果共获得１６个阳性克隆 （图３）。 图２ 第一次筛选ＴＡＣ２７文库的结果 １２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７ｌ８１９∞２１２２２３ 图３ 第二次筛选ＴＡＣ２７文库的结果 图４ 阳性克隆日ｉ Ⅲ酶切结果 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ ｎ ・・－・．．； －－０ ＿１簪 一『 奢 ■ 图５阳性克隆ＨｉｎｄⅢ酶切后杂交结果 维普资讯 http://www.cqvip.com 一ｌ０一 江苏农业科学２００６年第４期 ２。２ 阳性克隆转化水稻 ２．２．１ 抗性愈伤组织及再生植株的获得共培养 ２０００ｂｐ １ ０００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ １００ｂｐ 后愈伤组织干燥处理２—３ ｄ，然后接入筛选培养基， 非转化的愈伤组织１０ ｄ左右基本上褐化死亡，抗性 愈伤组织能迅速增殖（图６）。与ＴＡＣ１７转化相比 较，ＴＡＣ２７转化水稻时，筛选阶段抗性愈伤组织与 非抗性愈伤组织区分明显，且抗性愈伤组织在筛选 阶段就会表现出明显的抗性和增殖。而以ＴＡＣ１７转 化水稻时，经过两次、近一个月的筛选，抗性愈伤组织 与非抗性愈伤组织区分不明显，往往到预分化甚至分 化阶段才能区分开来。将抗性愈伤组织接入预分化 培养基中光照培养１５ ｄ左右，然后接入分化培养基 中进行分化成苗，有大量的再生苗出现（图７）。 图６ ＴＡＣ２７转化水稻的抗性愈伤组织筛选 图７ ＴＡＣ２７转化水稻抗性愈伤组织植株分化 ２．２．２转化植株ＰＣＲ检测 以ＴＡＣ２７载体Ｔ— ＤＮＡ区右侧植物标记基因 ￡基因部分序列为扩增 引物进行ＰＣＲ扩增。结果表明，以 ￡基因部分序 列扩增引物进行扩增时，转化植株均能扩增出与质 粒扩增带相同、大小为５６０ ｂｐ的带型（图８）。 ３讨论 ＴＡＣ载体系统已被广泛应用到植物基因工程 中，利用ＴＡＣ载体系统已经构建了拟南芥、大豆、百 １．空白对照（水）；２．阴性对照（未转化７００１Ｓ植株）；３．阳性 对照（ＴＡＣ１７质粒）； ．转化苗；Ｍ．分子量标记。 图８ ７００１Ｓ转化苗ｎｐｔ基因ＰＣＲ扩增结果 脉草、金鱼草、小麦、大麦、水稻等植物的基因组文 库。本研究所采用的基因组文库是小群体的混合基 因组文库，在进行文库筛选时经过两次筛选获得了 阳性克隆。同时，在点膜时采用对角线重复印膜，从 而可以避免假阳性结果的出现。本研究所利用的探 针能够筛选基因组文库成功获得阳性克隆，同时也 证明了所采用的基因组文库覆盖率大。 ＴＡＣ载体系统已经经过多次改造，目前已有 ＴＡＣ７、ＴＡＣ１７、ＴＡＣ２７、ＴＡＣ５３７等，以适应不同植物 材料和目的使用。ＴＡＣ１７和ＴＡＣ２７均以水稻肌动 蛋白ＡｃｔＩ为启动子，适合于单子叶植物的遗传转 化，它们的区别在于ＴＡＣ１７以ｂａｒ基因为筛选标记 基因，而ＴＡＣ２７以ｈｐｔ为筛选标记基因。研究表明 ＴＡＣ１７转化水稻是稳定、可靠的 ，但在筛选过程 中，不同基因型材料筛选剂浓度差异较大，且存在筛 选时间长以及转化体和非转化体难以区分等不足。 本研究采用ＴＡＣ２７转化水稻，结果表明ＴＡＣ２７的结 构在农杆菌和大肠杆菌中均是稳定的，以ＴＡＣ２７转 化水稻筛选效果好，筛选时间短，转化是成功的。从 而为水稻基因克隆和基因功能分析打下了基础。 参考文献： ［１］ｕｕＹＧ，ＳｈｉｒａｎｏＹ，ＦｕｋａｋｉＨ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｍｌｌ－ ｔａｍｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ—・ｃｏｍｐｅ－ ｔｅｎｔ ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｖｅｃｔｏｒ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］． Ｐｒｏｅ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９，９６：６５３５—６５４０． ［２］Ｌｉｕ Ｙ ｇ，Ｎａｇａｋｉ Ｋ，Ｆｕｊｉｔａ Ｍ，ｅｌ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ粕ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ—－ｉｎｓｅｒｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｌｉ－ ｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｈｅｘａｐｌｏｉｄ ｗｈｅａｔ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ—ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｒｔｉｉｆｃｉｌａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＴＡＣ）ｖｅｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌｎａｔ￣ｕｍａｌ，２０００，２３（５）：６８７ —６９５． ［３］“ｕＹＧ，ＬｉｕＨＭ，ＱｉｕｗＨ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｅｗｔｒａｎｓｆｏｒｍａ． ｔｉｏｎ—Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉ． ｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ｅｉｆｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００２，２８２：２４７—２５５． （下转第２ｌ页） 维普资讯 http://www.cqvip.com 李群等：麦田留高茬免耕抛秧稻生产技术 ～２１— ２．５动态施肥 ｄ后湿润、薄水抛秧。 ２．５．１ 施氮调节碳氮比 除按照常规抛秧高产肥 料运筹外，麦田秸秆直接全量还田第一年，因为麦草 ３．４适龄、薄水抛秧促早发 为碳氮比值高的秸秆而水稻为耗氮量大的作物，需 秧苗叶龄３．５～４．Ｏ叶，施用壮秧营养剂育秧的 要根据秸秆还田量，增施氮肥调节碳氮比，否则将造 叶龄可延迟至４．０～４．５叶，施好送嫁肥，适期薄水 成减产；第二年可以增施氮肥调节碳氮比，促进作物 抛秧。大田抛秧６５～７０￣／６６７ｍ ，折合２．６万～２．８ 的增产幅度；随着大量秸秆还田，营养元素释放，第 万穴／６６７ｍ （３苗／穴左右），基本苗７万～ 三年调节碳氮比与否，对作物产量无显著性影响。 ８万／６６７ｍ 。先迎风高抛，然后下田近距离补抛，抛 ２．５．２磷钾肥施用 根据田间肥力现状及变异趋 足、抛匀所需基本苗。 势，钾肥主要在分蘖盛期施用，后期主要依靠秸秆腐 ３．５大田水浆管理 解提供钾肥；磷肥以基肥为主，根据水稻产量目标， 抛后保持３～５ ｃａ３水层活棵；活棵后浅水促蘖， 适量增减。 并适时落于排酸增氧，避免还原性物质过多积累危 ３技术流程 害根系发育；达到预定苗数７０％～８０％时，适度搁 田，控苗促根；中后期湿润管理为主，以水调肥，促根 ３．１ 麦田沟系配套，适量播种 壮秆，浅水灌浆，活熟到老。 控制好麦子基本苗，田面畦宽２．５～３．０ ｍ，沟 ３．６大田肥料运筹 宽２０ ｃｍ，深２Ｏ～２５ ｃｍ，根据田间草相，适时化除。 施肥坚持采用“两头促，中间控”的原则，施纯 ３．２培育适龄壮秧 氮１８～２０ ｋｇ／６６７ｍ 。麦收后施碳酸氢铵２５～３０ 麦收前１５～２０ ｄ，进行晒种一药剂浸种一催芽 ｋｇ／６６７ｍ 上水沤制；抛秧５～６ ｄ活棵立苗后，施ＢＢ 一播种；按１：３５（秧田与大田面积比）备足苗床，塑 肥２Ｏ～２５ ｋｇ／６６７ｍ ＋尿素５～７．５ ｋｇ／６６７ｍ ，或尿 盘育秧、二段浇浆，大田用种３～３．５ ｋｇ／６６７ｍ ，播净 素１Ｏ～１２．５ ｋｇ／６６７ｍ ＋氯化钾７．５～１０ ｋｇ／６６７ｍ 种５Ｏ ｇ／盘（４３４孔），成秧１ １００苗／盘左右。秧田 ＋过磷酸钙２５～３０ ｋｇ／６６７ｍ ；施好平衡肥：抛秧后 施用塑盘育秧专用肥３５ ｋｇ／６６７ｍ ，水浆管理以湿润 １５～２０ ｄ，施尿素５～７．５ ｋｇ／６６７ｍ ，叶色深的田块 为主，３叶期后旱管，忌水层管理；采用无盘窗纱旱 可不施，叶色淡的则重施；穗肥：在叶龄余数２．５～３ 育技术，使用旱育保姆专用肥，培育壮秧，及时用药 时，施尿素１Ｏ・１５ ｋｇ／６６７ｍ ＋氯化钾１０ ｋｇ／６６７ｍ 。 控制病虫草危害，移抛时浇透水，增加水稻秧苗根部 ３．７病虫草综合防治 泥球。 在做好常规病虫草害综合防治的同时，特别注 ３．３ 高茬收麦，余草入墒，氮肥沤制 重灰飞虱防治，严控条纹叶枯病发生危害；中后期注 麦收时留高茬２Ｏ～３０ ｃｍ收割，余草斜插入墒 意防治纹枯病、稻曲病及螟虫、褐飞虱等病虫的危 沟，全量还田。灌水６～８ ｃｍ，施碳酸氢铵２５—３０ 害，确保丰产丰收。 ｋｇ／６６７ｍ ，调节碳氮比，加速麦草矿化腐解（如麦田 ３．８ 杂稻处理 杂草量大，上水前用灭生性除草剂清洁田面），５～７ 分蘖拔节期发现杂稻立即拔除。 （上接第１Ｏ页） ［６］郭熙志，刘耀光，罗达．以可转化人工染色体ＴＡＣ载体为基础 ［４］Ｓａｗａ Ｓ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｇｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａ１．ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ ＦＬＯＷＥＲ，ａ 的百脉根基因组文库的构建及筛选［Ｊ】．植物生理与分子生物 ｍｅｒｉｓｔｅｍ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｇｅｎｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ 学报，２００４，３０（２）：２３４—２３８． ｗｉｔｈ ａ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎａｄ ＨＭＧ—ｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ— ［７］Ｈ Ｌ，Ｑｕ Ｒ，Ｋｏｃｈｋｏ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌｆｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｎｔ，１９９９，１３：１０７９—１０８８． ｕｇｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９３，１２：２５０～ 【５］Ｓａｔｏ Ｓ，Ｋａｔｏ Ｔ，Ｋａｋｅｇａｗａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ— ２５５． ｂｏｕｎｄ ｅｎｄｏ一１，４一Ｂ—ｇｌｕｃａｎａ￣ＫＯＲＲＩＧＡＮ ｉｎ ｃｅｌｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｎｄ 【８］周玲艳，姜大刚，吴豪，等．基于ＴＡＣ载体的水稻转化系统的 ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， 建立［Ｊ］．遗传学报，２００５，３２（５）：５１４—５１８． ２００１，４２：２５１—２６３．
