食品中T-2毒素的测定 标准文本(食品安全国家标准)

1 范围

本标准规定了食品中T-2毒素的测定方法。

本标准第一法适用于谷物，酒类，酱油、醋、酱及酱制品中T-2毒素含量的测定，第二法、第三法适用于谷物中T-2毒素的测定。

本标准的方法检出限：第一法的对谷物的检出限为10μg/kg，对酒类、酱油、醋、酱及酱制品的检出限为5μg/kg。第二法的检出限为1μg/kg。第三法中直接法一的检出限为1μg/kg，直接法二的检出限为3.5μg/kg。

第一法 免疫亲和层析净化液相色谱法

2 原理

用提取液提取试样中的T-2毒素，经免疫亲和柱净化，浓缩、衍生、定容后，用高效液相色谱仪进行测定，外标法定量。 3 试剂和材料

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相当纯度的去离子水。 3.1 甲醇（CH3OH）：HPLC级。 3.2 乙腈（CH3CN）：HPLC级。 3.3 甲苯（C6H5CH3）：HPLC级。

3.4 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇，加20mL水。

3.5 4-二甲基氨基吡啶（DMAP）溶液：准确称取0.0325g于100mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。 3.6 1-氰酸蒽（1-anthroylnitrile，1-AN）溶液：准确称取0.0300g于100mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。

3.7 T-2毒素（T-2 toxin）标准品：纯度≥98%。免疫亲和柱。

3.8 T-2毒素标准溶液：准确称取适量的T-2毒素标准品，用乙腈配成浓度为0.5mg/mL的标准储备液，-20℃避光保存。使用前用乙腈稀释成适当浓度的标准工作液。 3.9 T-2毒素免疫亲和柱。 3.10 玻璃纤维滤纸。 4 仪器和设备

4.1 液相色谱仪配有荧光检测器。 4.2 粉碎机：转速10000r/min。 4.3 高速均质器：转速大于10000r/min。 4.4 氮吹仪。 4.5 离心机。 4.6 涡旋混合仪。 4.7 空气压力泵。

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4.8 试验筛：1mm孔径。 4.9 天平：感量0.001 g。

4.10 超声波发生器：功率大于180W。 4.11 玻璃注射器：10 mL。 5 分析步骤 5.1 提取 5.1.1 谷物

将样品研磨，硬质的谷物用粉碎机（4.2）磨细并通过试验筛（4.8），不要磨成粉末。称取25g(精确到0.01g)磨碎的试样于容量瓶中，用甲醇-水（8+2）（3.4）定容至100mL，混匀，转移至均质杯中高速均质2min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸（3.10）过滤至澄清，收集滤液于干净的容器中。 5.1.2 酱油、醋、酱及酱制品

称取25g(精确到0.01g)混匀的试样，用甲醇（3.1）定容至50.0mL，超声提取10min，定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸（3.10）过滤至澄清，收集滤液于干净的容器中。 5.1.3 酒类

取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20g(精确到0.01g)于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1）定容至刻度，摇匀，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸（3.10）过滤至澄清，收集滤液于干净的容器中。 5.2 净化

将免疫亲和柱（3.9）连接于玻璃注射器下（4.11），准确移取10.0ml 5.1中的提取滤液，注入玻璃注射器中。将空气压力泵（4.7）与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约1 滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体。以10ml水淋洗柱子1次，流速约为1 滴/s~2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。 5.3 洗脱

准确加入1.0 mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中。

5.4 衍生

5.4.1 T-2毒素标准工作液的衍生：取不同浓度的T-2毒素标准工作液各1mL，在50℃ 下用氮气吹干，加人50μL 4-二甲基氨基吡啶（DMAP）溶液（3.5）和50uL 1-氰酸蒽（1-AN）溶液（3.6），在涡旋混合器上混匀1min，50℃反应15min，在冰水中冷却10min后取出，50℃ 下氮气吹干，用1.0mL流动相（5.5）溶解，待HPLC测定。

5.4.2 样品的衍生：将5.3中洗脱液在50℃下用氮气吹干，按5.4.1步骤进行。 5.5 液相色谱参考条件

a) 色谱柱：C18柱，5μm，150mm×4.6mm或相当者； b) 流动相：乙腈+水(75+25)； c) 流速：1.0mL/min； d) 柱温：35℃； c) 进样量：20μL；

f) 检测波长：激发波长381nm，发射波长470nm。

5.6 色谱测定

以T-2毒素标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工

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作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中T-2毒素的响应值均应在仪器检测线性范围内。 在上述色谱条件下，T-2毒素标准品色谱图参见图A.1。 5.7 空白试验

除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。 5.8 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 5.9 结果计算

5.9.1 粮食及粮食样品：

试样中T-2毒素含量按式（1）计算： X式中：

X——试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克（µg/kg）； c1——试样溶液中T-2毒素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； c0——空白试样溶液中T-2毒素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——衍生化后甲醇定容体积，单位为毫升（mL）。 m——试样的质量，单位为克（g）； f——稀释倍数。

检测结果以两次测定值的算术平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。 6回收率

样品中T-2毒素添加浓度在10 µg/kg～100 µg/kg时，回收率在80 %～110 %之间。 7 精密度

在重复性条件下，获得的T-2毒素的两次测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

(c1c0)V1000f …………………………（1）

m1000

第二法 间接法

8 原理及依据

将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入 一定量抗体与待测试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后 ，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。 9 试剂和原料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 9.1 甲醇。

3

9. 2 石油醚。 9. 3 三氯甲烷。 9. 4 无水乙醇。 9. 5 乙酸乙酯。 9.6 二甲基甲酰胺。 9.7 四甲基联苯胺（TMB）。 9.8 吐温-20。

9.9 30%过氧化氢（30%H2O2）。

9.10 抗体：杂交瘤细胞系1D7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。 9.11 抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白（BSA）的结合物。 9.12 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物（酶标二抗）。 9.13 ELISA缓冲液系统。

9.13.1 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（Na2CO3）、2.93g碳酸氢钠（NaHCO3），加水稀释至1000mL。

9.13.2 洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称PBS-T）。配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、2.9g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8.0g氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.5mL吐温-20，加水至1000mL。

9.13.3 第五缓冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：

0.1mol/L柠檬酸（C6H8O7·H2O），称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液； 0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4），称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液；

取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。

9.13.4 底物溶液：取50μL TMB（10mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+10mL底物缓冲液+10μL 30%过氧化氢，混匀。

9.14 T-2毒素标准溶液：用甲醇配成1mg/mL T-2毒素储备液，-20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS（配备方法同PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。 10 仪器和设备

所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。 10.1 酶标检测仪。

10.2 酶标板（40孔或96孔）。 10.3 电动振荡器。 10.4 电热恒温水浴锅。

10.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。 11 分析步骤 11.1 提取

称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇（4+1），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4+1）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振荡1.5min，静置约15min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备；在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧）。

将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩

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瓶中，将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供 ELISA检测之用。 11.2 ELISA检测

11.2.1 用T-2-BSA（4μg/mL）包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。

11.2.2 酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样中的毒素含量）与抗体溶液的混合液（1+1，每孔100μL，该混合液应于使用前的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃ 1h。

11.2.3 酶标板洗3次，每次3min后，加入酶标二抗，每孔100μL，37℃ 1.5h。 11.2.4 同上述洗涤后，加入底物溶液，每孔100μL，37℃ 30min。

11.2.5 用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。 12 结果计算

样品中T-2毒素的含量（c）以纳克每克表示，按式（2）计算：

cm1式中：

V11D ………………………………（2） V2mc—T-2浓度，单位为纳克每克（ng/g）；

m1—酶标板上所测得的T-2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克（ng）； V1—试样提取液的体积，单位为毫升（mL）； V2—滴加样液的体积，单位为毫升（mL）； D—样液的总稀释倍数； m—试样质量，单位为克（g）； 13 精密度

在重复性条件下获得的两次测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

第三法 直接法

14 原理及依据

14.1 直接法一：将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与试

样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。

14.2 直接法二：基于竞争性酶联免疫反应，用甲醇/水振荡提取粉碎样品中的T-2毒素。处理后样品中的T-2毒素与T-2毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合的T-2毒素与T-2毒素酶标记物，然后加入反应底物，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中的T-2毒素含量。

15 试剂和原料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 15.1 甲醇。 15.2 石油醚。 15.3 三氯甲烷。

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15.4 无水乙醇。 15.5 乙酸乙酯。 15.6 二甲基甲酰胺。 15.7 四甲基联苯胺（TMB）。 15.8 吐温-20。

15.9 30%过氧化氢（30%H2O2）。

15.10 抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。

15.11 抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物（T-2-BSA）。 15.12 ELISA缓冲液系统。

15.12.1 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（Na2CO3）、2.93g碳酸氢钠（NaHCO3），加水稀释至1000mL。

15.12.2 洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称PBS-T）。配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、2.9g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8.0g氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.5mL吐温-20，加水至1000mL。

15.13 T-2毒素检测试剂盒：包括包被有抗体的微孔条，T-2毒素标准液，T-2毒素酶标记物，T-2毒素抗体，底物，样品稀释液，反应停止液。

15.14 T-2毒素标准品：用乙腈作为溶剂配制制成200μg/mL的储备液，于-4℃条件下保存。 15.15 样品稀释液：pH值为7.2的磷酸盐缓冲液（简称PBS）。配制方法为：分别称取0.55g磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O），2.85g磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）和9g氯化钠，用水溶解并定容至１L。如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（大于1：7），应向此缓冲液中加入10% 的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为10%。 16 仪器和设备

所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。 16.1 酶标检测仪。

16.2 酶标板（40孔或96孔）。 16.3 电动振荡器。 16.4 电热恒温水浴锅。

16.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。 16.6 天平：感量0.01g。 16.7 均质器。 16.8 粉碎机。 17 分析步骤 17.1 提取

17.1.1 直接法一：称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇（4+1），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4+1）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振荡1.5min，静置约15min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧）。

将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中，将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供 ELISA检测之用。

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17.1.2 直接法二：将样品按四分法缩分至1kg，全部磨碎至颗粒可通过20目筛大小，混匀，均分成两份作为试样，分别装入清洁的容器内，密封，并标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。称取25g试样（精确到0.01g），加入125mL 甲醇-水（7+3），均质1min~2min，5000r/min离心10min。离心后取50μL 滤液加入300μL 样品稀释液，混匀。取50μL进行酶联免疫测定，最后稀释倍数为35。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进一步稀释，直至样品中毒素浓度在标准曲线范围以内。 17.2 ELISA检测 17.2.1 直接法一

17.2.1.1 用T-2-BSA（4μg/mL）包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。

17.2.1.2 酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样中的毒素含量）与抗体-酶结合物溶液（1+100）的混合液（1+1，每孔100μL，该混合液应于使用前的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃ 1.5h。

17.2.1.3 酶标板洗3次，每次3min后，加入底物溶液。每孔100μL，37℃ 30min。 17.2.1.4 用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。 17.2.2 直接法二

17.2.2.1 将测定需用的微孔条插入微孔架，记录标准液和样液在微孔架上的位置。吸取50μL T-2毒素标准液和样液至各微孔。

17.2.2.2 吸取50μL T-2毒素酶标记物至各微孔，均匀混合，依次加入50μL T-2毒素抗体，混合，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，于22℃~25℃黑暗避光处孵育１h。

17.2.2.3 倒出孔中液体，以250μL 蒸馏水反复清洗微孔，重复操作3次以上，将微孔倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。

17.2.2.4 迅速加入100μL 底物至各微孔，于22℃~25℃黑暗避光处孵育30min。

17.2.2.5 孵育完毕后加入100μL 反应停止液至各微孔，充分混匀，上酶标仪测量并记录每个微孔试液450nm 波长处的吸光度值（加入反应终止液后应在30min内读取吸光度）。

标准校正曲线见图A.2。 18 结果计算

18.1 直接法一：样品中T-2毒素的含量（c）以纳克每克表示，按式（3）计算：

cm1式中：

V11D ………………………………（2） V2mc—T-2浓度，单位为纳克每克（ng/g）；

m1—酶标板上所测得的T-2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克（ng）； V1—试样提取液的体积，单位为毫升（mL）； V2—滴加样液的体积，单位为毫升（mL）； D—样液的总稀释倍数； m—试样质量，单位为克（g）； 18.2 直接法二：

标准品和样品的OD平均值除以零标准（A1、A2）的平均OD值，再乘以100，计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为100%（最大吸光度值），其他OD值为最大吸光度值的百分数。以吸光度的百分比值（B/B0）为纵坐标（%），T-2毒素标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的T-2毒素浓度后，结果按式（4）进行计算：

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X式中：

cV1000 ………………………………（4）

m1000X—样品中T-2毒素的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

c—从标准工作曲线上得到的样品中T-2毒素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V—样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）； m—样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。

也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。计算结果扣除空白值，所得结果保留一位小数。 19 回收率

直接法二：本方法T-2毒素添加浓度

添加量为3.5μg/kg时，回收率为80.9%~90.0%； 添加量为14μg/kg时，回收率为.3%~96.4%； 添加量为56μg/kg时，回收率为90.4%~97.0%； 添加量为100μg/kg时，回收率为98.5%~106.4%。

20 精密度

直接法二：本方法在大麦中的精密度为7.0%~11.3%，在高粱中的精密度为5.6%~11.4%，在小麦中的精密度为4.5%~11.3%，在玉米中的精密度为8.2%~16.0%。

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附 录 A

图 A.1第一法T-2毒素标准品的液相色谱图

图 A.2第三法T-2毒素标准品标准校正曲线

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