殷乐（内蒙古鄂尔多斯市药品检验所 东胜 017000）
摘要 目的：建立劳门十三味散中羟基红花黄色素A的含量测定。方法：选用高效液相色谱法。结果：线性范围0.1124μg～1.1240μg （r=0.9997），平均回收率为98.31%，RSD为1.08%。结论：本法可作为劳门十三味散中羟基红花黄色素A含量测定的一种准确、灵敏、可行的方法。
关键词 HPLC法；劳门十三味散；羟基红花黄色素A；含量测定
劳门十三味散为经过多年临床实践的传统蒙药验方，由天竹黄、丁香、紫檀香、甘松、甘草、木香、紫草茸、红花、檀香等十三味药组成。主要用于清热、解毒、润肺。处方中红花的黄色素和红色素成分由黄酮类化合物组成，水溶性黄色素的主要成分包括红花黄色素A、B、C，近来年的研究还发现了羟基化的红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A）为主要成分[1]。标准制定过程中，以羟基红花黄色素A作为测定指标，采用高效液相色谱法对本品中的红花建立了含量测定方法。通过实验摸索，确定了比较理想的色谱条件，并经过方法学考察及阴性对照实验，表明该方法操作简单，重现性好，专属性强，方中其它组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰，故认为可作为劳门十三味散含量测定方法。
1.仪器与试药
1.1仪器：岛津LC-10AT泵、岛津SPD-10A检测器、岛津CLASS-VP色谱工作站。岛津uv-1700型紫外分光光度仪。Sartorius BP211D型电子分析天平、Precisa 92SM-202A型电子分析天平。
1.2试剂与试药：羟基红花黄色素A对照品（批号111637-200503），中
国药品生物制品检定所提供；劳门十三味散供试品三批（批号分别为2006019、2006042、2006060），由阿拉善盟蒙医院提供；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。 2.分析方法验证 2.1色谱条件
2.1.1色谱柱：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，本实验研究采用Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5μm）及Kromasil ODS柱（250mm×4.6mm，5μm）。
2.1.2流动相的选择：参照《中国药典》2005年版一部“红花”项下的流动相比例进行流动相条件摸索，样品保留时间太短，经调整流动相比例为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至6.0±0.1）(26∶2∶72),羟基红花黄色素A峰与其它成分达到较好的分离度，并具合适的保留时间，并解决了拖尾现象，故采用上述流动相。
2.1.3柱温：采用40℃柱温，可降低流动相粘度，降低柱压，故将柱温定为40℃。
2.1.4检测波长的选择：取羟基红花黄色素A对照品溶液，于紫外可见分光光度仪上，自200nm～700nm做光谱扫描，羟基红花黄色素A在波长402nm与226nm处有最大吸收，结合《中国药典》2005年版一部“红花”项下的规定，选用403nm作为检测波长。
2.1.5理论板数的确定：对多批供试品测定结果表明，羟基红花黄色素A峰的理论板数在3000以上即能达到与相邻峰分开，并符合《中国药典》规定R＞1.5的要求，故本标准规定理论板数按羟基红花黄色素A峰计不得
低于3000。
2.2提取方法的选择及提取效率的考察：参照《中国药典》2005年版“红花”项下，以25%甲醇作为提取溶剂进行超声处理，实验中考察了超声30分钟、45分钟、60分钟等不同提取时间对提取效率的影响，结果羟基红花黄色素A含量（mg/g）分别为1.69，1.72，1.72。可见超声处理45分钟后，对供试品中羟基红花黄色素A的含量没有太大的影响，故将提取时间定为超声处理45分钟。
2.3专属性
2.3.1对照品溶液的制备：精密称取羟基红花黄色素A对照品适量 ，加25%甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。
2.3.2供试品溶液的制备：取本品粉末约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率50kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。
2.3.3空白阴性对照试验：按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液。另取按处方比例并以相同工艺制备的缺红花的阴性对照供试品，按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪，测得结果为：阴性对照色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其它组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。
2.4线性关系考察：取羟基红花黄色素A对照品约14mg，精密称定，
置25ml量瓶中，加25%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀（含羟基红花黄色素A56.2μg/ml），然后精密吸取上述溶液2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl分别进样，按上述色谱条件测定，以峰面积对羟基红花黄色素A的进样量进行回归分析，结果羟基红花黄色素A在0.1124μg～1.1240μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=2647483.4X－4077.1 r=0.9997。
2.5稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、24h进样测定，结果羟基红花黄色素A峰在24小时内的面积积分值基本稳定不变。RSD(%)为0.47。
2.6精密度
重复性试验：取同一批号（批号2006042）供试品6份，各约1.5g，精密称定，分别按专属性项下的供试品溶液制备方法操作；羟基红花黄色素A对照品溶液制备：精密称取羟基红花黄色素A对照品溶液0.00709g
25%甲醇 25ml，精密量取2ml
25%甲醇 10ml。结果其RSD为0.50%。
2.7准确度
加样回收试验：取供试品（批号2006042，含量1.719mg/g）9份，各约0.75g，精密称定，其中1、2、3号各精密加入用25%甲醇配置的羟基红花黄色素A对照品溶液（羟基红花黄色素A浓度1.2756mg/ml）0.5ml，4、5、6号各精密加入上述对照品溶液1ml，7、8、9号各精密加入上述对照品溶液1.5ml，分别按专属性项下的供试品溶液制备方法项下方法操作，测定每份供试品含量，计算回收率，结果平均回收率为98.31%，RSD为1.08%。
2.8耐用性试验：换不同厂家、不同型号的色谱柱，取重复性试验中的4、6号供试品及对照品分别进样，测定含量，结果4、6号供试品Phenomenex C18柱与Kromasil ODS柱所测含量 (mg/g) 相对误差（%）分别为0.46和0.20。
3.样品含量测定：取本品按专属性项下的供试品溶液制备方法处理并测定，羟基红花黄色素A对照品溶液制备：精密称取羟基红花黄色素A对照品溶液0.00709g加25%甲醇至25ml，精密量取2ml加25%甲醇至10ml。三批样品的含量（mg/g）测定结果分别为1.731，1.724，1.726。
4.讨论
4.1标准制定过程中，曾考察了甘草中甘草酸的含量测定方法，但甘草阴性有干扰，分离不好，故未给其建立含量测定方法而选择了红花的羟基红花黄色素A为主要成分作为测定指标采用高效液相色谱法，确定了比较理想的色谱条件。
4.2红花药材的含量考察，不同产地及采收加工对红花药材的羟基红花黄色素A的含量有一定的影响，故建议本制剂在投料之前严格进行红花药材把关。
参考文献
[1]药用植物学与生药学（第4版）.人民卫生出版社.第423页
[2]国家药典委员会，《中华人民共和国药典》（一部）[S].科学工业出版社.2005
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