２０１０。２６（８） Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ７６９ 文章编号：１００２—２６９４（２０１０）０８—０７６９—０３ ＰＲＵ株弓形虫包囊感染小鼠模型的建立＊ 李亚飞 ，王 寒。，潘长旺 ，谭 峰。 摘 要：目的 建立一个合理、经济的弓形虫包囊小鼠感染模型，为弓形虫的相关研究提供参考。方法 ２Ｏ个ＰＲＵ株弓 形虫包囊分别感染Ｃ５７ＢＩ ／６Ｊ、ＩＣＲ、ＫＭ或ＢＡＬＢ ｃ四个品系雌性小鼠１Ｏ只，感染后４２ ｄ，统计小鼠存活率、脑组织包囊数和 包囊直径。结果 ＫＭ小鼠存活率１００ （１０／１０），ＩＣＲ小鼠存活率７Ｏ （７／１０），Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ存活率１Ｏ （１／１０），ＢＡＬＢ／ｃ全部 死亡（０／１０）；ＩＣＲ小鼠包囊数和包囊直径与ＫＭ小鼠相比具有显著性差异（Ｐ＜０．０１）：ＩＣＲ鼠脑组织包囊数为１３８５．７１± ３７８．５５５，直径为４．０４４±０．１８７ ｍ；而ＫＭ鼠脑组织包囊数为２９０．００±１２９．７４３，直径为３．５５７±０．２７ｌ ｍ。结论 与其他３ 个品系小鼠相比，ＩＣＲ小鼠对ＰＲＵ株弓形虫包囊的抗性较强，可以作为弓形虫包囊感染模型。 关键词：弓形虫；包囊；小鼠模型 中图分类号：Ｒ３８２．５文献标识码：Ａ Ｍｏｄｅｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｎ ｍｉｃｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｃｙｓｔｓ ｏｆ ＰＲＵ ｓｔｒａｉｎ ＬＩ Ｙａ—ｆｅｉ ，ＷＡＮＧ Ｈａｎ。，ＰＡＮ Ｃｈａｎｇ—ｗａｎｇ ，ＴＡＮ Ｆｅｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ ３２５０３５，Ｃｈｉｎａ ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ ３２５０３５，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ（Ｔ． ｇｏｎｄｉｉ）ｃｙｓｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔＯ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｔｕｄｙ ｉｎ丁．ｇｏｎｄｉｉ．Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ １ ０ ｆｅｍａｌｅ ｍｉｃｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，ＩＣＲ，ＫＭ ａｎｄ ＢＡＬＢ／ｃ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｃｙｓｔｓ ｏｆ Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＰＲＵ ｓｔｒａｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｙｓｔｓ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅｓ，ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｆｔｅｒ ４２ ｄａｙｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ １００ （１０／１０），７０ （７／１０），１０ （１／１０）ａｎｄ ０（Ｏ／ｌＯ）ｆｏｒ ＫＭ，ＩＣＲ，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ａｎｄ ＢＡＬＢ／Ｃ ｍｉｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｃｙｓｔｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩＣＲ ａｎｄ ＫＭ ｍｉｃｅ（Ｐ＜０．０１）：Ｉｎ ＩＣＲ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｙｓｔｓ ｗａｓ １３８５．７１±３７８．５５５ ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｗａｓ ４．０４４±１．６１７５ ｕｍ；ｗｈｉｌｅ ｉｎ ＫＭ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｙｓｔｓ ｗａｓ ２９０．００－－４－１２９．７４３ ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｗａｓ ３．５５７±０．２７１ ｕｍ．Ｉｔ’Ｓ ｓｕｇｇｅｓ— ｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＩＣＲ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔＯ ｓｅｒｖｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ｃｙｓｔｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ；ｃｙｓｔ；ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ 弓形虫病是一种人兽共患性疾病，中间宿主在 教研室传代保存。 １．２ 实验动物 雌性ＢＡＬＢ／Ｃ、ＩＣＲ、ＫＭ、Ｃ５７ＢＬ／ 感染弓形虫后大多为隐性感染，以包囊的形式存在 于宿主中，引起相应的炎症病变和变态反应，从而影 响中间宿主的正常生长，严重者可导致中间宿主的 死亡。因此，为寻求弓形虫弱毒株的研究常需要获 得大量包囊、建立对包囊敏感或耐受的动物模型等。 我们在前期实验工作中发现，不同品系小鼠在感染 ６Ｊ小鼠各１０只，体重在１８￣２２ｇ。所有实验动物均 购于温州医学院实验动物中心。 １．３ 弓形虫包囊的分离与感染 按文献 方法分 离包囊，将感染小鼠经颈椎脱臼法处死后取脑组织， 置于研钵中再加入约５ ｍＬ ＰＢＳ研磨成匀浆。随机 取上述匀浆３次，每次ｌ０ Ｌ制片置于显微镜（４０ 弓形虫后，其脑组织中包囊携带率明显不同。本实 验用弓形虫包囊感染不同品系小鼠（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、 倍）下计数包囊数，求得３次计数平均包囊值，再计 ＩＣＲ、ＫＭ和ＢＡＬＢ／ｃ）后，观察小鼠存活率、脑组织 包囊携带率以及包囊直径，从而建立一个合适、经济 的小鼠感染模型。 １材料与方法 ＊浙江省科技厅面上社会发展项目（Ｎｏ．２００９Ｃ３３０３５）资助 通讯作者：谭峰，Ｅｒｎａｉｌ：ｔａｎｆｅｎｇｓｏｎｇ＠１６３．ＣＯＬＴ＊ 作者单位：１．温州医学院检验医学院与生命科学学院，温州 ３２５０３５； １．１ 虫株 弓形虫ＰＲＵ株，由温州医学院寄生虫 ２．温州医学院基础医学院，温州 ３２５０３５ ７７０ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 算出总包囊数。根据总包囊数，用灌胃针口饲感染 ２ ４种不同品系小鼠ＰＲＵ株弓形虫包囊（２０个包囊／ 只），观察小鼠４２ ｄ，并记录小鼠死亡情况。 １．４脑组织包囊分离与计数小鼠感染后４２ ｄ，将 存活小鼠统一颈椎脱臼法处死，取脑组织匀浆后用 ＰＢＳ稀释至２．５ ｍＬ，随机取ｌＯ Ｌ匀浆制片置于显 微镜（４０倍）下计数包囊，计数１０次（即共１００ Ｌ）， 求出２．５ ｍＬ匀浆液总包囊数。 ＫＭ ＩＣＲ １ 包 囊１ 数 实验感染小鼠分组 １．５计数包囊直径取上述匀浆液少许，制片置于 显微镜（４０倍），于标尺下随机记录每只小鼠各５０ 个包囊直径。 １．６统计分析采用ＳＰＳＳ１３．０软件，数据以均数 ±标准差表示，做单因素方差分析和Ｇａｍｅｓ—Ｈｏｗ— ｅｌｌ检验的两两比较。 ２ 结 果 ２．１ 小鼠感染包囊４２ ｄ存活情况 ＢＡＬＢ／ｃ和 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ这２种小鼠感染弓形虫包囊后死亡率比 较高，８ ｄ后开始死亡，到第１６ ｄ仅余１只Ｃ５７ＢＬ／ ６Ｊ小鼠存活，ＩＣＲ小鼠相对ＢＡＬＢ／ｃ和Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ 两个品系对弓形虫有较强的耐受，在感染后死亡率 较低，而ＫＭ小鼠在感染弓形虫包囊后，没有死亡， 见图１。 １ＯＯ Ｏ Ｏ ｌ０ ２Ｏ ３Ｏ ４０ ５０ ｄａＶ 图１ 感染包囊后小鼠存活情况 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｉｃｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｙｓｔ ２．２ 小鼠脑包囊计数 由于Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠只存 活１只，故不做统计。ＫＭ小鼠脑组织包囊数为 ２９０．００±１２９．７４３，ＩＣＲ小鼠脑组织包囊数为１３８５． ７ｌ－－＋－３７８．５５５，两品系小鼠脑组织包囊数存在显著性 差异（Ｐ％０．０１），其中ＩＣＲ小鼠脑组织中包囊数显 著多于ＫＭ小鼠脑组织包囊数，见图２。 ２．３小鼠脑包囊直径比较 ＩＣＲ小鼠脑组织包囊 直径为４．０４４±０．１８７／，ｍ，而ＫＭ小鼠脑组织包囊直 径为３．５５７±０．２７１ ｍ，经统计学分析，ＩＣＲ小鼠脑组 织包囊直径显著大于ＫＭ小鼠包囊直径（Ｐ＜０．０１）。 图２存活小鼠脑组织包囊数比较 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｙｓｔｓ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖｅｄ ｍｉｃｅ ３ 讨 论 迄今为止，许多研究人员对弓形虫感染小鼠情 况进行过不同的研究，如感染途径、包囊最多时间、 组织分布、包囊超微结构等。刘俊燕等 通过３个 不同途径感染Ｆｕｋａｙａ株弓形虫速殖子后发现经腹 腔和皮下感染弓形虫容易形成包囊。Ｚｅｎｎｅｒ∞ 研究 过小鼠口服包囊后在体内脏器中的分布情况。包安 裕等 研究过弓形虫慢性感染小鼠脑内包囊主要分 布在海马和大脑皮层。苗绪红等 观察过小鼠脑组 织中包囊的超微结构。然而不同品系小鼠对于弓形 虫包囊的形成和生长尚无相关报告，因此本文就此 进行了相关的实验研究。 刘俊燕等㈤发现弓形虫速殖子经口感染常会被 胃酸破坏，而包囊具有一定的抵抗力，用包囊感染容 易成囊，成囊率接近１００ 。张爱民“ 发现在感染 弓形虫后２８～４２ｄ包囊数最多。因此，本实验运用 弓形虫包囊经口感染小鼠，感染４２ｄ后进行检测，这 是为了获得较多的弓形虫包囊，也是为了实验的可 操作性和结果的可靠性。 本文采用灌胃法将弓形虫包囊经消化道途径感 染Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ和ＢＡＬＢ／ｃ两种近交系小鼠，以及 ＩＣＲ和ＫＭ两种封闭群小鼠，观察感染后小鼠的死 亡情况和其脑组织中的包囊情况。本实验表明，近 交系小鼠在实验感染第１６ ｄ后仅余１只Ｃ５７ＢＩ ／６Ｊ 小鼠，存活率比较低，说明近交系小鼠存在某种缺 陷，抵抗力低，不利于弓形虫的长期保种，但可以作 为弓形虫敏感模型运用于实验。封闭群小鼠存活率 比较高，其中ＫＭ小鼠存活率为１００ ，其更适合应 用于弓形虫的长期研究，可作为耐受模型。 本实验对存活的两组小鼠脑组织中的包囊数进 行了计数、比较，脑组织中形成的包囊数目平均值依 次为Ｃ５７ＢＩ ／６Ｊ＞ＩＣＲ＞ＫＭ（存活Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠 脑组织包囊为１９７５），其中Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ和ＩＣＲ脑组 织中的包囊数远远超过ＫＭ小鼠，基本是其４倍以 ２０１０，２６（８） 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａ１ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ７７１ 上，说明这两个品系小鼠比较容易在短时间内获取 大量弓形虫包囊，而ＫＭ小鼠在实验期中形成的包 囊数目较少，不利于包囊的大量收集。 最后，我们通过比较包囊直径发现，ＩＣＲ小鼠脑 适合作为耐受动物模型进行弓形虫的相关研究。 参考文献： ［１］张爱民，陆琴，杨惠珍，等．弓形虫脑组织包囊两种分离法的比较 ［Ｊ］．中国人兽共患病杂志，１９９６，１２（３）：３９ ４０． 组织中的包囊直径相对ＫＭ小鼠脑组织中的包囊 直径大。这种差异可能与动物机体内的免疫状态有 ［２］刘俊燕，杨秀珍，吴增强，等．不同途径感染弓形虫小鼠在脑内形 成包囊的研究［Ｊ］．中国人兽共患病杂志，２００５，２１（７）：６１ ６－６１９． ［３］Ｚｅｎｎｅｒ Ｉ ，Ｄａｒｃｙ Ｆ，Ｃａｐｒｏｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ：ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ 关，此外，由于本实验中各组动物数量较少，可能存 在个体差异，这还需要进一步扩大动物数量进行验 ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ（Ｊ；．Ｅｘｐ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９９８，９０（１）：８６—９４． ［４］包安裕，王惠玲，王高华，等．弓形虫慢性感染小鼠脑内包囊分布 证。由于包囊中含有的主要为弓形虫缓殖子阶段， 因此，包囊直径越大，缓殖子数量也越多。这对于收 的研究［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２００６，２２（９）：８３７－８３９． 集弓形虫缓殖子进行相关研究提供了很有利的实验 ［５］苗绪红，杨秀珍，杨树森．弓形虫包囊超微结构的观察［Ｊ］．天津 医科大学学报，２００１，４（７）：４９９—５０１． 平台。 ［６］刘俊燕，杨秀珍，吴增强．弓形虫慢性感染鼠形成包囊的实验研 无论如何，本实验发现，与其他３个品系小鼠相 究［Ｊ］．天津医科大学学报，２００１，２（７）：１ ７６—１ ７８． 比，ＩＣＲ小鼠对ＰＲＵ株弓形虫包囊的抗性较强，更 收稿日期：２０１０ ０５—０１；修回日期：２Ｏ１０—０７一ｌ５ （上接第７６８页） ２５４５ ２５５ ７． 用Ｎ基因核苷酸序列构建的系统进化树显示， ［５］Ｚｈａｎｇ ＹＺ，Ｘｉｏｎｇ ＣＩ ，Ｚｏｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ４株病毒亲缘关系很近，具有地域性特征。与我国 ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｄｕｒｉｎｇ ２００４［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，２００６， １２１（２）：１７９—１８８． 北京、河北、云南、湖南、贵州等地分离株及印度尼西 ［６３李浩，陶晓燕，宋淼，等．狂犬病高发地区犬只感染情况调查分析 亚分离株、泰国分离株同源性较高，进化关系较近。 ［Ｊ］．中华实验和临床病毒学杂志，２００８，２２：１６卜１６４． 该结果与以往我国各地的研究报道相一致，进一步 ［７］Ｗｕｎｎｅｒ ＷＨ，Ｌａｒｓｏｎ ＪＫ，Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉ— 说明我国各地主要流行的狂犬病毒毒株系统发育关 ｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１９８８，１０（Ｓ４）： Ｓ７７１—７８４． 系较近，并且与印度尼西亚、泰国等东南亚国家的流 ［８］Ｄａｖｉｄ Ｄ，Ｙａｋｏｂｓｏｎ Ｂ，Ｓｍｉｔｈ ＪＳ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ 行毒株可能来源于同一祖先。 ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｉｓｒａｅｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ Ｎｅａｒ Ｅａｓｔ 参考文献： ｅｒｎ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ（Ｊ；．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３８（２）：７５５－７６２． ［１］Ｂｏｕｒｈｙ Ｈ，Ｋｉｓｓｉ Ｂ，Ｔｏｒｄｏ Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙｓｓａｖｉｒ— ［９］熊成龙，郝宗字，卢思奇，等．河南省两株狂犬病毒核蛋白及糖蛋 ｕｓ ｇｅｎｕｓ［Ｊ３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９４（１）：７０—８１． 白基因的序列分析［Ｊ］．中华流行病学杂志，２００７，２８：２６１－２６７． ［２］熊成龙，张永振，卢思奇，等．狂犬病毒生物学特征研究进展［Ｊ］． ［１Ｏ］徐葛林，Ｌｉ Ｋｕ，吴杰，等．中国１９个狂犬病病毒街毒分离株Ｎ 中华流行病学杂志，２００６，２７（１０）：９１３ ９１ ６． 基因的序列分析［Ｊ］．病毒学报，２００３，１８：４８—５１． ［３］Ｆｕ ＺＦ，Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ Ｂ，Ｓｃｈｕｍｃｈｅｒ ＣＩ ，ｅｔ ａ１．Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏ— ［Ｕ］Ｋｉｓｓｉ Ｂ，Ｔｏｒｄｏ Ｎ，Ｂｏｕｒｈｙ Ｈ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｂｉ— ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｉｓ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ａｓ ｅｓ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２０９（２）： ａ ｖａｃｃｉｎｅ（Ｊ｝．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９１，８８（５）：２００１—２００５． ５２６—５３７． ［４］Ｂｏｕｒｈｙ Ｈ，Ｋｉｓｓｉ Ｂ，Ａｕｄｒｙ Ｉ ，ｅｔ ａ１．Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｒａ— 收稿日期：２０１０—０２—１８；修回日期：２０１０—０４—１６ ｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ［Ｔ］．Ｔ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，ｌ９９９，８０（Ｐｔｌ０）：
