芦荟超氧化物歧化酶稳定性研究_许平

重庆师范大学学报(自然科学版)

JournalofChongqingNormalUniversity(NaturalScienceEdition)

Ju.l2007Vo.l24No.3

芦荟超氧化物歧化酶稳定性研究

许 平

(重庆师范大学生命科学学院,重庆400047)

*

摘 要:本文研究了在不同pH、温度条件下从芦荟中提取的超氧化物歧化酶的稳定性,结果表明:芦荟超氧化物歧化酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,其作用的最适pH值为8.2,最适温度为40~55e。关键词:芦荟;超氧化物歧化酶;pH;温度;稳定性中图分类号:Q949.71+8.23;Q554

文献标识码:A

文章编号:1672-6693(2007)03-0057-03

AResearchofStabilityonSuperoxideDismutasefromA.VeraL.

XU Ping

(CollegeofLifeScience,ChongqingNormalUniversity,Chongqing400047,China)

Abstract:ThisstudydiscussesthestabilityofSuperoxidedismutasefromA.veraLatdifferentpHontemperature.There-sultsshowthattheSODfromA.veraLhasbetterthermallystabilityandpHstability,theoptimalpHis8.2andoptimaltem-peratureisfrom40to55e.

Keywords:A.veraL.;superoxidedismutase;pH;temperature;stability

超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD,EC1.15.1.1)是一类广泛存在于生物体内的氧化还原酶

[1]

1材料与方法

1.1材料与仪器

实验用库拉索芦荟,购于重庆市天星桥花卉市

场;DEAE-52、SephadexG100为Watman公司产品;其余试剂均为国产分析纯。7550紫外可见分光光度计;2323K高速冷冻离心机;FA1004A电子天平;BS2-100自动部分收集器厂;DYY-Ó8A电泳仪;精密pH计等。1.2方法

1.2.1酶的分离纯化 新鲜芦荟制备粗酶液;硫酸铵分段盐析;SephadexG-100分子筛柱层析;DEAE-52柱层析冷冻干燥,浓缩得纯化的SOD酶蛋白。SOD活力测定采用改良的邻苯三酚自氧化法

[7-8]

。植物在整个生长发育过程中受到大气污

染、极端温度、水分胁迫、强光、盐渍和病原菌侵染,使细胞产生大量的活性氧,它们对细胞有明显的毒害作用,能与蛋白质、核酸和脂类发生作用,引起蛋白质失活、降解、DNA链断裂和脂质过氧化等现象,导致细胞结构和功能的破坏。植物抗氧化保护酶类有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等,其中SOD第一个参与活性氧的清除反应,在抗氧化酶类处于核心地位。芦荟(Aloevera)为百合科植物,含有丰富的蒽酮类物质、粘多糖、多肽、氨基酸、维生素、矿物质、叶绿素、生物活性酶及蛋白质等多种抗氧化功能的活性成分,植物来源的SOD等抗氧化酶及其它抗氧化物

[6]

质在医药和化妆品等的使用已越来越广泛;本文通过对库拉索芦荟(AloebarbadensisMiller)SOD的稳定性的研究,为芦荟的开发利用提供科学依据。

[2-5]

,

邻苯三酚自氧化速率325nm,0.070D/min左右,以1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。

1.2.2芦荟SOD最适pH的研究 用磷酸氢二钠

*收稿日期:2006-11-10

资助项目:重庆师范大学科研基金项目

作者简介:许平(1956-),女,江苏宜兴人,副教授,研究方向为蛋白质分离与纯化。58

重庆师范大学学报(自然科学版) http://www.csxbz.com 第24卷

-柠檬酸缓冲液配制pH范围为2~8的缓冲液,用甘氨酸-氢氧化钠配制pH范围为9~10的缓冲液,测

定SOD活力。以30e时酶样最大光吸收值的酶活力为100%,在其它条件下的酶活力为最大光吸收值的百分数,即为该酶在此温度条件下的相对活力。1.2.3芦荟SOD最适温度的研究 在最适pH条件下,设置不同的反应温度,并测定该条件下的SOD酶活力,以酶样最大光吸收值的酶活力为100%,在其它温度下的酶活力为最大酶活力的百分数,即为该酶在其它温度下的相对活力。1.2.4芦荟SOD的pH稳定性研究 取酶液加入

上述不同的pH缓冲液,在30e依次保温1h、2h、3h,以0h下酶活力为100%,测定各pH在不同时间

下的相对酶活力。

1.2.5芦荟SOD温度稳定性的研究 取酶液分别在20e、40e、50e、60e、70e下保温,分别检测20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min时的酶活力变化,以0min时酶样的活力为100%,测定各时间作用下的相对酶活力。

2结果与讨论

图1 pH对酶活性的影响 图2 pH对酶活性的影响 图3 温度对酶活性的影响

2.1芦荟SOD最适pH的研究

根据不同pH下的SOD活力绘制图1、图2,在pH5~8.5范围内,芦荟SOD活力呈上升趋势,pH达8.2时酶活力达最大,以后随pH的增高,其酶活力呈下降趋势,当pH为8.6时,酶活力为96%,pH为9时,酶活力为86%,最适pH在8.2左右,这表明芦荟SOD是一种对pH值变化比较稳定的酶;这种高稳定性与该酶分子中的金属辅基有关。2.2芦荟SOD最适温度的研究

如图3所示,温度在20~40e时,酶活力呈上升降趋,50~55e达最大,60e后酶活力逐渐下降,70e后酶活力明显下降,最适温度在40~55e之间,80e时其活力还剩32%。芦荟SOD有较高的耐热性,原因在于金属辅基的存在

[9]

由表1和图4可知,芦荟SOD在pH5随时间的延长酶活力明显减弱,在其它不同的pH(6~9)值的缓冲液中随着时间的延长其相对活力都在85%以上,25epH9保温3h相对活力还剩92。SOD是酸性蛋白,在pH7.0~9.0时性质最稳定,热稳定性好

[10]

。芦荟SOD对pH的变化不敏感并有

较强的耐受性,这种高稳定性与该酶分子中的金属辅基有关,在较低的pH值条件下,酶分子中绝大部分锌从结合位点解离,而在很高的pH条件下,可能是酶分子中的2个金属位点被铜占据,从而使酶分子的

表1 芦荟SOD的pH稳定性

pH值56

789

相对酶活力(1h)/%

80.395.198.099.696.8

相对酶活力(2h)/%

73.191.9

95.499.092.5

相对酶活力(3h)/%

58.484.990.398.491.9

,去除金属辅基其

热稳定性大大降低,这也是芦荟能适应干旱炎热环境的原因。

2.3芦荟SODpH稳定性的研究

图4 不同pH下作用时间对酶活性的影响 图5 不同温度下作用时间对酶活性的影响 图6 芦荟SOD对化学试剂敏感

构型发生不可逆的转变并丧失其活性

[9]

。2.4芦荟SOD热稳定性的研究

第3期 许 平:芦荟超氧化物歧化酶稳定性研究

59

由图5可见,芦荟SOD在50e、140min酶活性稳定,60e、100min后酶活性下降5%,20e随时间的延长酶活力增加,70e、100min相对酶活力保持90%,70e、140min相对酶活力还保持85%,这表明芦荟SOD对温度有较高的耐受性,酶分子的构象决定其活性,而构象又受环境的影响,在一定的温度和时间范围内酶分子的构象发生某些变化可提高酶的活性,但温度过高时间过长酶反而会变性失活。2.5酶的种类鉴定

[11]

根据有关文献,Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感,Cu,Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感,Fe-SOD对氰化物不敏感,用这两种抑制剂实验将3种SOD分开。H2O2、KCN溶液作用30min(30e)后,相对活力为13.6%和25.1%,从图6可见KCN和H2O2对芦荟SOD的抑制作用明显,是SOD的抑制剂,芦荟SOD为Cu,Zn-SOD。

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(责任编辑 李若溪)

3结论

SOD是生物体内的催化剂,其活性和催化效率的高低与其含量的多少有关,也与环境中理化因素

[12]

的影响直接有关,为了最大限度地发挥催化反应的高效率,寻找最有利的反应条件,本文研究了温度、pH对芦荟SOD活力的影响,结果表明芦荟SOD对pH和温度有较高的稳定性和耐受性,使其在应用时允许有较大的pH值及温度变化范围,从而使得芦荟SOD有更好的开发应用前景。参考文献: