基于ITS序列分析铁皮石斛试管苗的亲缘关系

顾慧芬1，庄意丽1，梅其春2

（1. 上海市中药研究所 上海 201203；2. 复旦大学生命科学学院 上海 200433）

摘要：采用分子系统学方法分析铁皮石斛试管苗及其近缘种的遗传多样性，为准确进行基源鉴定、阐明属内的种间关系及发现新的药用资源提供分子证据。采集三十多种石斛样品分离提取DNA， PCR扩增ITS区及5.8S rDNA完整序列并测序，用Mega 3.1软件进行系统学分析。采用邻接法和最大简约法分析铁皮石斛试管苗亲缘关系，对三十多种石斛类植物的ITS区序列进行分析，两种方法得到的系统树基本一致。ITS序列在石斛种间存在极其显著的差异，铁皮石斛与其它各种石斛均有各自特异性的序列位点，树状图显示铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛源于同一物种，而石斛属其它种与这两种遗传关系较远。

关键词：铁皮石斛试管苗；ITS序列；系统发育；亲缘关系 所属专业：生化与生物技术药物

The Phylogenetic Relationships of Tissue Culture Seedlings of Dendrobium candidum Based on Evidences from ITS Sequences

GU Hui-fen1 ，ZHUANG Yi-1i1 ，MEI Qi-chun2

(1．Shanghai Institute of Chinese Materia Medica，Shanghai 201203，China； 2．School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200433，China)

Abstract： Molecular systematic techniques were applied to reveal the genetic diversity of medicinal plant of Dendrobium candidum and their related species in Dendrobium. The internal transcribed spacer (ITS) as well as 5.8S rDNA sequences of more than 30 samples of Dendrobium were amplified using PCR method and sequenced．Mega 3.1 was used to analyze the genetic diversity within genus. Phylogenetic relationships among species in Dendrobium and tissue culture seedlings of Dendrobium candidum as outgroup were estimated by maximum parsimony and neighbor—joining methods with Mega 3.1 software，and similar ITS trees were obtained with the two methods. The results of phylogenetic analysis also indicate that the tissue culture seedlings of Dendrobium candidum has a closed relationship with Dendrobium candidum, while both Dendrobium candidum and tissue culture seedlings of Dendrobium candidum are the most distant to the other species of Dendrobium.

Key words：tissue culture seedlings of Dendrobium candidum；ITS sequence；phylogeny；relationship

铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl），为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）多年附生草本，是我国传统名贵中药之一，为石斛之上品，具有润喉消毒、生津益胃、清热养阴等功效。药理研究显示铁皮石斛是一类很有价值的中药类免疫增强剂[1]-[2]，临床上也广泛的用于肿瘤病人手术及化疗后的辅助治疗。随着铁皮石斛研究的不断深入，市场对铁皮石斛的需求也不断增大。近年来通过无性繁殖即组织培养培植试管苗，获得了成功，实现了资源的可持续开发和利用。药用植物在采用组织培养等进行繁殖和人们

在栽培的过程中，由于改变了其生态环境和人类的干扰，其遗传特性等方面是否会发生变化，也是人们关注的问题之一。

随着分子生物技术的迅速发展，DNA分子标记技术在中药鉴定方面的应用已取得了许多进展[3]-[10]。由于rDNA的ITS区域具有较多的碱基变异信息，在长度上具有较好的保守性，因此近10年来被广泛地用于植物属间与种间系统关系的研究。

ITS 之所以成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记，主要基于以下两个方面原因：第一，作为18S226S rDNA 的一个组成部分，ITS 在核基因组中是高度重复的，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化，这就为对PCR 扩增产物直接测序奠定了理论基础；第二，DNA 测序工作的难易程度及成本与DNA 片段长度有密切关系，裸子植物ITS 区的长度变化范围很大，而被子植物的ITS 区长度则比较稳定，包括5. 8S rDNA 在内，总长度只有600～700 bp，为测序带来了很大方便。

本研究利用rDNA 的ITS对石斛属植物的序列进行比较分析，旨在探讨其种间的遗传变异以及它们之间的亲缘关系，为铁皮石斛试管苗系统学研究提供资料。

1 材料和方法

1.1样品收集

实验材料的名称和来源具体见表1，铁皮石斛试管苗由中药研究所提供，其中野生铁皮石斛分别采自云南、广西等产区, 金钗石斛来自于南京，石斛其它种类均采自于云南。

表1、材料名称和来源

Tab．1 Origin and n01Tte 0f plan tmaterials

编号 材料名称 1 D. devonianum 齿瓣石斛Ⅰ 2 D. devonianum 齿瓣石斛Ⅱ 3 D. strongylanthum梳唇石斛 4 D. crystallinum冒晶石斛Ⅰ 5 D. crystallinum冒晶石斛Ⅱ 6 D. aduncum钩状石斛 7 D. moniliforme 细茎石斛Ⅰ 8 D. primulinum报春石斛 9 D. henryi疏花石斛 10 D. moniliforme 细茎石斛Ⅱ 11 D. falconeri 串珠石斛 12 D. sp好竹签 编号 材料名称 13 D. aphyllum 兜唇石斛 14 D. chrysanthum束花石斛 15 D. crepidatum玫瑰石斛 16 D. hercoglossum 重唇石斛 17 D. monticola藏南石斛 18 D. linawianum短唇石斛 19 D. bicolor二色金石斛 20 D. gratiosissimum杯鞘石斛 21 D. pendulum 肿节石斛 22 D. chrysotoxum鼓槌石斛 23 D. trigonopus翅梗石斛 24 D. fimbriatum马鞭石斛 编号 材料名称 25 D. thyrsiflorum球花石斛 26 D. candidum铁皮石斛 E 30 D. candidum铁皮石斛 A 31 D. candidum 铁皮石斛 A（干品） 32 D. nobile 金钗石斛Ⅰ 33 D. .nobile 金钗石斛 Ⅱ 34 D. nobile 金钗石斛 Ⅲ 35 D. nobile 金钗石斛 Ⅳ 36 D. candidum 铁皮石斛.C 38 D. candidum 铁皮石斛F 39 D. candidum 铁皮石斛 D 40 D. candidum 铁皮石斛B 注：铁皮石斛A为组培试管苗； B、C、D、E、F分别采自云南、江西、福建、广东、广西

1.2 方法

1.2.1 DNA 抽提

选择表1样品适宜叶片和茎0.1g左右，剪碎后液氮研磨，加入800μl CTAB-free [100mmol/L Tris/HCl（pH=7-8），5mmol/L EDTA ,0.35 mmol/L山梨醇，1% PVP]，12000r离心6min。弃上清，加入600μl左右65℃预热的2×CTAB抽提缓冲液[100mmol/L Tris/HCl（pH=8），1.4mol/L NaCl，2% PVP， 20mmol/L EDTA，2 %CTAB（w/v），0.34 % 巯基乙醇（v/v）]，65℃保温60min。取出后冷却到室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），抽提，离心10min。取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），再次抽提，离心。取上清液，加入1/10体积的NaAc，2/3体积的异丙醇（-20℃预冷），混匀之后放入-20℃保存30min左右，12000r离心10min。弃上清， 70%乙醇洗涤2次，37℃烘干乙醇，

加入50μl TE溶解。4℃保存备用。 1.2.2 ITS片段的PCR扩增与序列测定 引物的设计与合成

设计铁皮石斛ITS序列一对引物，由上海生物工程有限公司合成。 引物：

ITS1（5’-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT-3’） ITS2（5’-GTAAGTTTCTTCTCCTCCGCT-3’） ITS区片段的PCR 扩增

PCR反应在20µl的体系，每个反应体系中包括10ng基因组DNA，2mM MgCl2 ，0.2mM dNTPs，1U的Taq DNA聚合酶，10mmol/L This-HCl，以及各0.5μmol/L的正向和反向引物。PCR反应在2700PCR Amplfier热循环仪中进行。PCR反应参数：94℃预变性3 min，94℃变性45 sec，58℃退火45 sec，72℃延伸60 sec，10个循环，94℃变性45 sec，54℃退火45 sec，72℃延伸60 sec，30个循环。72℃延伸 10 min ，反应结束后，产物置4℃保存。扩增得到核糖体DNA的ITS片段(包括ITS1，5.8S rDNA和ITS2)。 PCR产物的序列测定

测序反应在MJ Research公司的PTC-200 PCR仪上进行，反应程序为：96℃变性10 sec，50℃退火10 sec，6O℃ 延伸4 min，25个循环，反应总体积为1Oμl。用Bigdye循环测序试剂盒在ABI公司(美国应用生物系统公司)ABI 3730全自动测序仪上进行正、反链双向测序。 1.2.3 序列分析

DNA序列的排序用CLUSTAL X软件完成，排序后的序列使用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）3.1分子进化遗传分析软件，Kimura-2参数遗传距离（Kimura-2 parameter genetic distance），采用邻接法和最大简约法构建NJ系统树和MP系统树，系统树各分支的置信度用自展检验法（bootstrap test）检验，共进行2000次循环，以评价各分支的系统学意义与可靠性。

2 结果与分析

选择了ITS (内转录间隔区)的片段，采用热启动PCR的方法对铁皮石斛试管苗、6种不同产地野生铁皮石斛及二十多个石斛类品种进行了扩增。获得了由ITS序列绘制的NJ系统树和MP系统树。

图1：根据ITS区序列数据用Kimura 2-参数距离计算出的NJ系统树

Fig．1 The neighbor-joining tree using Kimura’s two-parameter distances based on ITS sequences

邻接树的拓扑结构显示（图1），铁皮石斛的序列聚集在一起，形成一个分化支（自展值为99%）。其中两个亚分支由野生铁皮石斛和铁皮石斛试管苗组成的支持率相对较高（62％，71％），表明铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛源于同一物种。而石斛属其它种与这两种遗传关系相对较远。因此对于这种种内保守、种间分化活跃且差异明显的DNA 序列作为石斛属植物的分子标记是可行的。

图2：根据ITS区序列数据用Kimura 2-参数距离计算出的MP系统树

Fig．2 The single most parsimonious tree using Kimura’s two-parameter distances based on ITS sequences

最大简约树（图2）与邻接树相似，铁皮石斛的序列聚集在一起，形成一个分化支，但自展值相对较低为77%。拓扑结构显示，与邻接树一致，两个亚分支由野生铁皮石斛和组培铁皮石斛组成，但2个分支的支持率相对较低(31％，66％)。

3 讨论

从得到的序列结果以及根据序列结果绘制的一致性来看，聚类比较清晰，全部同种石斛都聚到一组，而且支持率也比较可观。 ITS序列在石斛种间存在极其显著的差异，铁皮石斛与其他各种石斛均有各自特异性的序列位点，树状图显示铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛源于同一物种，而石斛属其它种与这两种遗传关系较远。

近年来，随着生物技术的发展，一些珍贵、稀有、濒危的野生药用植物通过无性繁殖的方式，实现了这些药用植物资源的可持续开发和利用。通过对石斛属近30个种的序列比较分析，铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛源于同一物种，这为扩大药源和保证用药安全等提供了一定的科学证据。

ITS是近年来用于探讨植物种内、种间变异及近缘属间变异重要的分子标记技术之一。本实验通过对石斛属近30个种的序列比较分析表明，ITS区序列信息位点丰富，不同种的石斛属各类群均有多个特异性的单核苷酸变异位点，当根据石斛属植物的形态和药材性状难以鉴别种类时，ITS序列是可靠的分子鉴别标记。这一技术路线和方法的建立，为我国珍贵、稀有、濒危的地道药材的鉴定提供了一个可借鉴的鉴定平台。

参考文献

[1] 陈晓梅等，石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展，天然产物研究与开发，2000，13(1) [2] 黄民权等，铁皮石斛多糖对小白鼠白细胞和淋巴细胞移动抑制因子的影响，天然产物研究与开发，

1996，8(3)

[3] 曹晖等. DNA分子指纹图谱与测序技术在中药品质研究中的现状与展望. 中国中药杂志，1998， 23

（11）3-5.

[4] 聂晶等. 中药指纹图谱的研究现状. 中草药， 2000，31(12)：881-884.

[5] 刘玉萍等. DNA分析技术在中药质量研究中的应用. 中药新药与临床药理，1997，8（2）:112-115. [6] 张利等. 基于ITS序列分析仲彬草属植物的亲缘关系. 西北植物学报，2007，27(3)： 490—496 [7] 王迎等. 鼠尾草属药用植物及其近缘种的ITS序列分析. 药学学报，2007，42(12)：1309—1313 [8] Kitanaka S，Kunishi M，Taira T，et al. Ginsenoside production，tissue culture and induction of regeneration

of interspecific hybrid ginseng (Panax ginseng × P. quinquefolium). Natural Med，1997，51（1）：1-3. [9] Ngan FN，Wang J，But PPH，et al. Application of arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR)in

commercial ginseng products. 5 th International Congress of Plant Molecular Biology，Singapore，1997. [10] 顾慧芬等. 铁皮石斛试管苗的RAPD分析及其特异性鉴定引物设计. 复旦学报 2007，46（3）：401-405