琥珀酸产生菌的诱变与选育

林　剑，孙　莹，刘晓艳，徐世艾＊

（烟台大学化工制造省级重点实验室，山东　烟台　　　　　　２６４００５）

摘　　　要：对琥珀酸产生菌Ｓ－１进行紫外线亚硝基胍的复合诱变后，筛选出琥珀酸产量高，遗传性状稳定的菌株Ｓ－５７，并对其进行激光诱变，筛选出菌株ＳＨ－２４，相同发酵条件下琥珀酸产量达到２１．２５ｇ／Ｌ，相对于未诱变菌株产量提高了３４３倍。

关键词：琥珀酸；紫外线；亚硝基胍；激光；诱变

Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｓｕｃｃｉｎｉｃ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｓｔｒａｉｎ

ＬＩＮ　Ｊｉａｎ，ＳＵＮ　Ｙｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＸＵ　Ｓｈｉ－ａｉ＊

（Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，　Ｙａｎｔａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｙａｎｔａｉ　　　　　　　　２６４００５，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ａ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－５７　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｃｏｒ　Ｓ－１　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｒａｙ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ　（ＮＴＧ）．　Ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－５７　ｗａｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｅ－Ｎｅ　ｌａｓｅｒ，　ａ　ｓｔｒａｉｎ　ＳＨ－２４　ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ．　Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｓ　２１．２５　ｍｇ／ｍｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈａｔ　ｉｓ　３４３　ｔｉｍｅｓｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｅｆｏｒｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ；ｓｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｒａｙ；ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ；ｌａｓｅｒ；ｍｕｔａｔｉｏｎ

中图分类号：Ｑ９３９．９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００７）１２－０３０９－０４

琥珀酸（丁二酸，ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）及其衍生物由于广泛的使用于食品、医药、冶金、轻工、饲料生物燃料等各个领域，因此琥珀酸的生产成为备受关注的研究课题［１］。目前琥珀酸的生产主要是采用化学合成法［２］，其化学制备相当复杂，而且产品分离成本很高，这就对琥珀酸的应用带来了一定的，同时化学制备生产的琥珀酸也了它在食品、医药、饲料等行业的应用。开发发酵法生产琥珀酸的工艺以及发酵法生产琥珀酸的工业潜能在２０世纪８０年代初就已得到了世界性的共识，科学家预计２１世纪的第一个１０年是实现发酵法生产琥珀酸的关键时期。最近几年，随着人们对琥珀酸及其衍生物的生物学功能的进一步认识和应用领域的扩大，使得琥珀酸的市场需求快速增加，因此国外许多国家也加大了对发酵法生产琥珀酸的研究力度，发酵法生产琥珀酸工艺中涉及到的许多研究方向诸如：菌种的选育、发酵工艺的优化、产物分离等已成为有机酸发酵研究领域的一个热门课题，而我国在这方面的研究报道很少［３］。发酵法琥珀酸可以为现已存在的琥珀酸化学制品市场提供了一种经济、安全、绿色的琥珀酸来源。利用微生物菌种，以农产品玉米、木薯为基本原料，不仅可以得到安全的食品、医药级琥珀酸、生物燃料等同时还可以为农产品的深加工使其转化为高附加值产品提供一

条可行性的通道。

目前，国外已报道分离出的琥珀酸产生菌都是从瘤胃中分离出来的专性厌氧或兼性厌氧细菌，主要是典型的胃肠细菌例如：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ　ｓｐ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．和瘤胃细菌例如：Ｐｕｍｉｎｏｃｏｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｃｔｉｏｎｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｏｎａｓ　ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｄｅｘｔｒｉｎｉｓｓｏｌｖｅｎｓ等［３］。上述细菌性琥珀酸产生菌，都是在厌氧的条件下进行的液体培养，对发酵环境有着比较苛刻的要求，甚至需要通入ＣＯ２气体，另外琥珀酸作为酸性物质，其在发酵液中的合成与积累必然造成发酵液ｐＨ值的下降，而细菌性微生物的正常生长ｐＨ通常要求在７．０左右，这就给琥珀酸的发酵带来更大的困难，也是细菌性微生物琥珀酸发酵不可避免的需要解决的问题。针对上述情况，考虑到中国传统发酵食品例如白酒、黄酒在其发酵过程中都有一定量的琥珀酸生物合成这一事实，本实验室现已成功地从其生产用曲中分离出能够在好氧条件下合成并积累琥珀酸的霉菌菌株Ｓ－１。

本实验对琥珀酸产生菌Ｓ－１菌株采用紫外亚硝基胍复合诱变并结合激光诱变，以期筛选到产琥珀酸能力高的菌株，为进一步研究琥珀酸的有氧发酵生产奠定了基础。

收稿日期：２００６－１０－３１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊通讯作者

作者简介：林剑（１９６３－），男，副教授，学士，主要从事微生物发酵的研究。310 2007, Vol. 28, No. 12１１．１１．２

材料与方法出发菌种

食品科学１．４．２．２

激光照射诱变

※生物工程琥珀酸产生菌Ｓ－１，烟台大学生物工程实验室保存。主要设备

液相色谱仪Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　　　　安捷司；Ｈｅ－Ｎｅ激光发射器　　　　北京市六一仪器厂。１．３

培养基及培养条件

斜面培养基：马铃薯培养基；摇瓶筛选培养基：液体马铃薯培养基；筛选培养基：查氏培养基，加入０．０１％溴甲酚绿。斜面培养：温度３０℃，时间３ｄ。筛选培养：温度３０℃，时间３ｄ。摇瓶培养：温度３０℃，时间９６ｈ，转速２００ｒ／ｍｉｎ。

诱变方法

诱变的过程：紫外线剂量选择→紫外线亚硝基胍复合诱变→初筛→复筛→稳定性实验→激光剂量选择→激光诱变→初筛→复筛→稳定性实验１．４．１

紫外亚硝基胍复合诱变

１．４

根据上述选择的激光照射时间进行诱变，照射后的单孢子悬液涂布平板培养基，培养２ｄ，挑取变色圈与菌落直径之比较大的单个菌落接种斜面培养，进行摇瓶复筛，高产株进行稳定性研究。１．６

分析方法

发酵液中琥珀酸含量的测定：反相高效液相色谱法［７］。结果与分析

紫外线亚硝基胍复合诱变

紫外线剂量选择

孢子悬液经紫外线照射不同时间后，适当浓度涂布

２２．１２．１．１

培养，通过平板计数得到不同照射时间对死亡率、正突变率、负突变率的影响，见图１。

１００９０８０７０６０５０４０３０２０１００

９２．０８８．７８４．４７８．８７８．８７９．６８３．４２１．２２３．５１５．６１．４．１．１紫外线剂量选择

孢子悬液制备：用马铃薯培养基将培养３ｄ的新鲜孢子冲下，置于摇床２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃恒温培养３ｈ，使其萌芽。用生理盐水离心洗涤，并用两层擦镜纸过滤得到单孢子悬液，浓度为１０６～１０７个／ｍｌ。

１０ｍｌ菌悬液放入无菌培养皿中，在磁力搅拌器上用紫外灯照射，波长为２５３７ｎｍ，培养皿距离光源２０ｃｍ［４］，照射时间分别为２、３．５、５、６．５、８ｍｉｎ。

紫外线照射前后的单孢子悬液同时稀释，以适当浓度接种于固体培养基上，于３０℃恒温避光培养２ｄ，平板计数计算致死率，选择合适的照射时间。１．４．１．２合诱变

根据上述选择的紫外线照射时间，采用合适的ＮＴＧ处理液（３００μｇ／ｍｌ）进行紫外线与亚硝基胍的复合诱变［５］。处理后菌悬液接种于加入初筛培养基中，培养２ｄ，根据变色圈与菌落直径之比，与诱变前菌株比较，初步筛选直径之比较大的菌株。筛选得到的菌株接种斜面培养，进行摇瓶复筛，挑选出发酵液中琥珀酸浓度高的菌株，高产株进行稳定性研究。１．４．２１．４．２．１

激光诱变方法及筛选照射时间选择

孢子悬液制备同１．４．１，０．１ｍｌ孢子悬液放入无菌培养皿中，用Ｈｅ－Ｎｅ激光照射，波长为６３２．５ｎｍ，光斑直径２．５ｍｍ［６］。照射时间１０、２０、３０、４０ｍｉｎ。激光照射前后的单孢子悬液同时稀释，涂布筛选培养基培养２ｄ，平板计数计算死亡率，选择合适的照射时间。

亚硝基胍（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）和紫外线复

百分比（％）死亡率

正突变率负突变率

７０．２７６．５７７．３８．０２３．５５６．５

照射时间（ｍｉｎ）

图１　　　　紫外线照射时间对死亡率等的影响

Fig.1 Affections of mutagenic time of ultraviolet rays on

mortality etc.

诱变前活菌数－诱变后活菌数

死亡率＝————————————————

诱变前活菌数

正突变率＝诱变后变色圈直径与菌落直径之比大于诱变前变色圈直径与菌落直径之比的活菌数／诱变后活菌数

负突变率＝诱变后变色圈直径与菌落直径之比小于诱变前变色圈直径与菌落直径之比的活菌数／诱变后活菌数

由图１可以看出，照射时间小于５ｍｉｎ时，正突变率随照射时间的增加而增大，照射时间超过５ｍｉｎ后，正突变率随照射时间的增加而减小，考虑到正突变率是影响诱变效果的主要因素，确定复合诱变紫外照射时间为５ｍｉｎ。２．１．２

紫外线亚硝基胍复合诱变

根据上述实验选择紫外线照射时间５ｍｉｎ，亚硝基胍处理液浓度３００μｇ／ｍｌ，处理时间３０ｍｉｎ，对菌株进行复合诱变。

１１．３８

※生物工程食品科学１２０９８．０９３．５2007, Vol. 28, No. 12311选取经过紫外与亚硝基胍复合诱变后初筛得到的１２株高产菌株，在摇床水平上进行复筛，复筛结果见表１。

表１　　　　　摇瓶复筛结果

Table 1 Results of shaking-flask repeated screening菌号Ｓ－２Ｓ－６Ｓ－８Ｓ－１２Ｓ－１４Ｓ－１５Ｓ－１６Ｓ－１７

产量（ｇ／Ｌ）３．３０２．３９２．２４３．０７１．８１３．５０４．１０１．４０

提高倍数５３．２４３８．５４３６．１７４９．４７２９．２０５６．４０６６．２３４２２．５９

菌株号Ｓ－１８Ｓ－１９Ｓ－２７Ｓ－３１Ｓ－３２Ｓ－３５Ｓ－５３Ｓ－５７

产量（ｇ／Ｌ）３．９８３．１８３．９８４．６８６．２２６．９１６．２６１６．３０

提高倍数６４．１４５１．３５６４．１２７５．４３１００．２６１１１．２６１００．９７２６２．９２

百分比（％）８０６０４０１４．９６．５６２．５７６．３０

１０

２．０２０３０

照射时间（ｍｉｎ）

图２　　　　激光照射时间对死亡率等的影响

Fig.2 Affections of mutagenic time of He-Ne laser on

mortality etc.

注：原始出发菌株Ｓ－１在相同条件下发酵，发酵液的琥珀酸产量为

０．０６２ｇ／Ｌ。

时间为３０ｍｉｎ。２．２．２

激光照射诱变

根据上述实验选择照射时间３０ｍｉｎ，对菌株Ｓ－５７进行激光诱变，初筛得到的７株高产菌株，在摇床水平上进行复筛，复筛结果见表３。

表３　　　　　摇瓶复筛结果

Table 3 Results of shaking-flask repeated screening菌号产量（ｇ／Ｌ）提高率（％）

ＳＨ－１９２０．０７２３．１２

ＳＨ－２０１９．５０１９．６２

ＳＨ－２４１９．５７２０．０６

ＳＨ－２５１９．８８２１．９７

ＳＨ－３５１６．５８１．７１

ＳＨ－３６１７．４３６．９１

ＳＨ－３７１６．８４３．３０

从复合诱变结果看出紫外亚硝基胍复合诱变可以较大幅度提高菌株产琥珀酸能力。选取琥珀酸产量高的５株菌株Ｓ－３１、Ｓ－３２、Ｓ－３５、Ｓ－５３、Ｓ－５７进行稳定性研究。对于上述５株高产菌株进行了五代稳定性实验，其结果见表２。

表２　　　　　传代数对琥珀酸产量的影响(g/L)

Table 2 Affections of trainer time on succinic acid yield (g/L)传代数１２３４５

Ｓ－３１３．５６４．７４４．３２３．２３．５４

Ｓ－３２６．１１６．５４５．３２５．６９４．３５

Ｓ－３５６．９１７．０５６．８５７．１２７．２３

Ｓ－５３６．０６５．９９４．１３５．４５５．７６

Ｓ－５７１６．３１１５．６４１６．２４１６．４５１６．６３

由表２可以看出菌株经紫外亚硝基胍复合诱变后，菌株Ｓ－５７产琥珀酸能力较其他菌株稳定，并且有提高的趋势，发酵液中琥珀酸浓度为１６．６３ｇ／Ｌ。琥珀酸是三羧酸循环的中间体，推测通过紫外与亚硝基胍复合诱变，可能通过遗传基因发生突变使代谢过程中的琥珀酸脱氢酶合成受阻或活性减弱，存在丙酮酸羧化支路，琥珀酸得以累积并排到细胞膜外，其理论的明确解释还需要进一步研究。２．２２．２．１

Ｈｅ－Ｎｅ激光诱变照射时间的选择

用波长６３２．５ｎｍ的Ｈｅ－Ｎｅ激光对Ｓ－５７菌悬液分别照射１０、２０、３０、４０ｍｉｎ，适当浓度涂布培养，通过平板计数得到不同照射时间与致死率，正突变率，负突变率关系见图２。

致死率、正突变率、负突变率计算方法同２．１．１。

由图２看出，照射时间小于３０ｍｉｎ时，正突变率随照射时间的增加而增大，照射时间超过３０ｍｉｎ后，正突变率随照射时间的增加而减小，正突变率是衡量诱变效果的主要依据，确定激光对菌株Ｓ－５７进行照射诱变的

从实验结果可以看出，Ｓ－５７菌株经过Ｈｅ－Ｎｅ激光照射后琥珀酸产量提高幅度较小。选择琥珀酸产量较高的４株菌株ＳＨ－１９、ＳＨ－２０、ＳＨ－２４、ＳＨ－２５进行五代稳定性研究，实验结果见表４。

表４　　　　　传代数对琥珀酸产量的影响(g/L)

Table 4 Affections of trainer time on succinic acid yield (g/L)传代数１２３４５

ＳＨ－１９２２．０８２２．０６１９．３５２０．６５１８．３２

ＳＨ－２０１９．３２２０．０３１９．５６２０．５６２０．５４

ＳＨ－２４２０．３５２０．０１２０．８１２１．３６２１．２５

ＳＨ－２５２１．２６２０．５６２０．１５１９．５６１６．０３

由实验结果可以看出菌株ＳＨ－２４产琥珀酸能力较稳定，发酵液中琥珀酸浓度达到２１．２５ｇ／Ｌ。

菌种经过激光诱变虽然琥珀酸产量提高幅度不大，但是由液相色谱谱图看出发酵液中其他有机酸所占比重有较大幅度下降。

目前对激光照射诱变微生物的理论研究还不完善，并且未见对毛霉的激光诱变报道，对于激光照射诱变虽然没有较大幅度提高菌体的产琥珀酸能力，但是却降低

８．４２０１１．３８８．７８９．７１００死亡率正突变率负突变率４０

９１．６312 2007, Vol. 28, No. 12食品科学※生物工程稀土元素镨、钕、铒对红菇多糖

深层发酵的影响

李增利

（江苏科技大学南徐学院食品与环境系，江苏　镇江　　　　　　　２１２００４）

摘　　　要：研究了稀土元素镨、钕、铒对红菇深层发酵中红菇菌丝生物量、胞外多糖（ＥＰＳ）、胞内多糖（ＩＰＳ）、总多糖（ＴＰＳ）、最终ｐＨ和多糖产率的影响。研究结果显示：稀土元素显著影响着菌丝生物量、ＥＰＳ、ＩＰＳ、ＴＰＳ、最终ｐＨ和多糖产率；其影响水平受限于稀土元素的种类和稀土元素含量，适当剂量的稀土元素镨、钕具有促进红菇菌丝体生长作用和代谢产物的积累，而过高浓度的稀土元素则会造成对细胞生长和多糖产物抑制作用。在添加适宜的剂量稀土元素镨时能够获得较高的生物量、胞外多糖产量、胞内多糖产量、总多糖和胞外多糖产率，其分别达到２４．６３±０．６２ｇ／Ｌ、１．７３０±０．０６５ｇ／Ｌ、７９．０３±０．００ｍｇ／ｇ、３．５１１±０．０２８ｇ／Ｌ、７．６０％±０．１５％。关键词：红菇；深层发酵；多糖；稀土元素；镨；钕；铒

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｒａｒｅ　Ｅａｒｔｈ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｒａｓｅｏｄｙｍｉｕｍ　，　Ｎｅｏｄｙｍｉｕｍ　ａｎｄ　Ｅｒｂｉｕｍ　ｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

ｂｙ　Ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｕｓｓｕｌａ　ｓｐ．

ＬＩ　Ｚｅｎｇ－ｌｉ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，　Ｎａｎｘｕ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ　　　　　　　　　　　２１２００４，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｒａｒｅ　ｅａｒｔｈ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＲＥＥ）ｏｆ　ｐｒａｓｅｏｄｙｍｉｕｍ，　ｎｅｏｄｙｍｉｕｍ　ａｎｄ　ｅｒｂｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ａｄｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉａ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅｉｒ收稿日期：２００７－０８－１２

作者简介：李增利（１９６６－），男，副教授，主要从事食品加工方面的研究。

其他有机酸副产物的原因，可能经过诱变糖代谢的路径发生变化，其具体原因还需进一步研究。

对琥珀酸产生菌进行紫外亚硝基胍复合诱变与激光照射诱变后，筛选到的菌株ＳＨ－２４发酵液中琥珀酸浓度达到２１．２５ｇ／Ｌ，较诱变前提高了３４３倍。证明作为传统诱变方法，复合诱变较之激光照射诱变能够大幅度提高琥珀酸产率，仍然是微生物诱变育种的重要方法，激光照射作为一种新型诱变剂，其诱变机理尚未研究清楚，但是操作方法简单，与传统诱变方法相结合，是提高诱变效果的好方法。３３．１

结　　论

菌株Ｓ－１经紫外亚硝基胍复合诱变后，筛选到一

２４，相同条件下摇瓶发酵液中琥珀酸浓度为２１．２５ｇ／Ｌ，产量较未诱变前提高３４３倍。

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支菌株Ｓ－５７，相同条件下摇瓶发酵液中琥珀酸浓度为１６．６３ｇ／Ｌ。３．２

菌株Ｓ－５７经过Ｈｅ－Ｎｅ激光诱变后筛选到菌株ＳＨ－