western 一抗,二抗以及显色实验步骤

动科101 余美华

一抗处理（his-tag抗体）

① 用平头镊子将PVDF膜夹至小饭盒中（蛋白面朝下），加适量PBS缓冲液，将小饭盒置于摇床上，摇晃五分钟。再重复两次。

② 称取牛血清蛋白40mg溶于2mlPBS中，配成浓度为2%的溶液。

③ 将PVDF膜轻轻夹取到密封的小袋中，加入②中配好的溶液，排去气泡，封好袋口。将小袋子放在小饭盒中，冰浴摇晃1h。

④ 按稀释倍数为1:1000将适量的his-tag抗体加入小袋中，轻轻混匀，封好袋口。（无需换袋，直接加入即可，此次试验我们加入了2μl抗体） ⑤ 将装置放在摇床上，冰浴，过夜处理。

二抗处理（辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG）

① 用PBS洗一抗后的膜，每次5分钟。再重复两次 ② 以二抗抗体：PBS=1:1000的比例配好二抗体系

③ 用平头镊子将PVDF膜放入干净，密封性良好的小袋中，加入二抗体系，轻轻混匀，排去气泡，封上袋口。

④ 将装置放在摇床上，冰浴，摇晃2h。

DAB辣根过氧化物酶显色

① 用PBS洗二抗后的膜，每次5分钟。再重复两次

② 按照DAB显色液A：DAB显色液B=1:1的比例配制成DAB染色工作液。

③ 最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，将蛋白面朝上置于干净的保鲜膜上，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。

④ 室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 ⑤ 去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。 ⑥ 显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)染色

① 用PBS洗二抗后的膜，每次5分钟。再重复两次

② 用平头镊将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置 于一洁净保鲜膜上。

③ 按BeyoECL Plus A液：BeyoECL Plus B液=1:1的比例配置BeyoECL Plus工作液。 ④ 根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml BeyoECL Plus工作液的比例，滴加BeyoECL Plus工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1-2分钟。

⑤ 取膜，弃BeyoECL Plus工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。用干净的保鲜膜将膜包好，随后进行压片检测或荧光成像仪检测。

⑥ 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。然后观察结果

动科101 余美华

显影液的配制

A. 准备约3000毫升40-50℃的蒸馏水。加入可配制1加仑的显影剂A，充分搅拌至完全溶解。 B. 待显影剂A完全溶解后再加入显影剂B，充分搅拌至完全溶解。

C. 待显影剂B完全溶解后再加入显影剂C，充分搅拌至完全溶解。定容到1加仑，即3785毫升。

D. 冷却至20-25℃后，放置过夜 (不少于12小时) 。 E. 然后用滤纸过滤后即可使用。

定影液的配制

A. 准备约2300毫升40-50℃的蒸馏水。加入共可配制1加仑的定影剂A(共两瓶)，充分搅拌至完全溶解。注: 定影剂A共两瓶，配制时必须一次全部倒入；由于两瓶内药品未均匀分装，所以不能只倒入一瓶来配制0.5加仑。

B. 待定影剂A完全溶解后再加入定影剂B，充分搅拌至完全溶解。

C. 待定影剂B完全溶解后再加入定影剂C，充分搅拌至完全溶解。定容到1加仑，即3785毫升。

D. 冷却至20-25℃后，放置不少于1小时。

E. 然后用滤纸过滤后即可使用。