中药化学成分传统提取分离方法经验浅谈
实验前
1.在从事研究之前一定要认真查阅与课题相关的文献资料。做到心中有数，即怎样来提取是最好的？怎样来解析植物中特征类型的化合物？别人都做了哪些方面的工作了？等等。象我的课题植物主要含有生物碱类成分，我就选择先用稀酸浸泡，再用阳离子交换树脂交换富集，就把叶绿素，多糖等杂质除掉了，同时生物碱含量也提高了，给后来的分离工作带来了很大的帮助。
2.天然药物或中药一定要在做之前确定其基原（植物来源）。这很重要，不然会给文献检索带来麻烦。
3.要抓重点，学会放弃。因为我觉得一个植物中的化学成分成千上百。我们不可能把它全部拿到，所以我们实验中要拿那些量稍大的、容易拿的。不要上了很久的柱子，分到后面得到的量还不够打谱就不好了。你可以从最后结题剩下的几百个浸膏流份瓶子看到这一点。
4.实验过程中要小心每一步，三思而后行。因为你的浸膏来之不易。往往不再给你重来的机会。
5.要给自己信心，要敢于想，敢于尝试。 第一步 1. 跑板：
在上样之前，你必须熟知你样品是处于什么状态，特别是自己要的化合物的 点是处于什么状态，选用什么柱子（粗长砍断；细长快冲纯化除杂），什么固定相（硅胶，正相柱除极性小的化合物；凝胶，一般用于纯化，分离离得较近的点，反相硅胶，除极性大的杂志等）
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选梯度，淋洗剂的选择。 感觉上要使所需点在rf0.2～0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。 (1)、洗脱剂的选择，一般是以第一个点在TLC上Rf值0.2～0.3为基础，稀释一倍进行第一个样品点的洗脱，并在洗脱下第一个点后更换下一个点的洗脱极性（0.2～0.3稀释一倍）。
2．准备工作：准备一个蒸馏瓶，一根滴管（标有样品名字），一些样品瓶，留点母液。
3．样品称量：样品的称量是选柱子的标准，所以一定要准确200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。
4.选柱子：注意跑柱子就是多次跑薄层板的过程，所以让点在薄层板上冒个点就表示你在柱子硅胶里照样能跑出来。(注意给自己标上自己样品名哦) 关于柱子的尺寸
选柱子根据你样品量为选，应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分
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rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，但没有验证过。 5. 2.关于湿法、干法上样
湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。
湿法上样，搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。 6. 装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。 干法装柱简单方便，只要垫实即可，保证平面平整。
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱
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子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，加压可以消除气泡，或者放置过夜，如果硅胶还没沉淀下来，没有上样品，可以重新用玻璃棒搅拌一下，让它重新上样。
变花是由于柱子中气泡的存在，放置过夜和过快更换洗脱极性都会产生气泡。装柱子时一定要搅拌使得硅胶中的气体尽量拍干净。更换极性时，我一般从50:1到20:1是逐渐更换的，就是先到40:1，30:1在到20:1。这样更换，放热就不明显。
过常压柱子时，为什么过柱过程中柱子内会有气泡，怎样避免，遇到这种情况应该怎样处理？ 若是硅胶柱，还没有上样的话，可以搅一搅，让其自然沉降就可以；若是已经上了样品，就只好加压赶赶气泡试试。
一般过硅胶柱如何避免产生气泡： 1.装柱之前应搅拌均匀，然后装柱； 2.装柱尽可能一次性的装完， 3.过柱的时候，你是否干过柱，这也会产生气泡； 4.还有你在装完柱后，最好在硅胶上方加一片圆形滤纸，加上后再加一块棉花，这样加溶剂冲洗时，可以避免冲起硅胶，产生气泡； 如果气泡已经产生，可以： 1.加压驱赶气泡； 2.我自己也发现了一个方法，你试试，就是先不要冲洗，放置过夜，第二天早上气泡就会到了上面，不过有的时候不行。 3.如果还不行，就用高极性的溶剂冲下样品，收集，重新装柱。
湿法装柱要点： 1.估算柱子硅胶用量 2.估算溶剂与硅胶混合量 3.将溶剂与硅胶于烧杯中搅拌均匀，应搅至无气泡 4.用漏斗装柱，尽可能一次性加完. 5.反复加溶剂平衡柱子，至柱床不再下降为止。 6. 加样有两种方法，可溶于以上溶剂的样品，可用适量溶剂溶解后，将溶剂放平柱床后直接加样；还可用适宜溶剂溶解
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样品，用适量硅胶拌样，硅胶量以能分散样品即可，尽量少，以减小初始色带，加样时，柱床上留少量溶剂，加样后，应轻敲柱子样品带的四周，使气泡上移，样品带上加棉花或盖少量硅胶，防止加溶剂时冲动样品层，加好样后连续冲柱时间尽量长些，至少10小时以上，可基本消除气泡的产生。
7. 压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
8. 上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～4cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。
9．过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。注意如果开始时样品没有那么快下来，可以多接几瓶再旋，中间要换梯度，最好就是要点板决定，具体根据板来换。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后
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出。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，如果都用小试管那工作量又太大。
实验过程中要粗中有细，上大柱粗分时，合并流份时要粗，就是说TLC行为大体一致的流份都可以合并，这样可以避免一些重复的实验，不然分到的成分重复的厉害。但到了后来的细分时，就要小心合并每一瓶了，不然自己的辛勤劳动就会白费了。
作为天然药化的研究生，冲柱子是一个基础手段。流分的合并，一般靠TLC检测来确定合并，首先，色谱行为和主斑点这两个概念没有必要分得很清，就是说，做实验没有一个不变的规定，合并也不单纯靠TLC，有时感觉也很重要。对于我。一般是以主斑点为主要参考。因为主斑点一样，色谱行为也不会相差很大了. 10. 检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
11. 送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
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