第３８卷第５期 ２０１３年１０月 贵 阳 医 学 院 学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩＹＡＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＶＯ１．３８ Ｎｏ．５ ２０１３．１０ ・论著・ 脐带间充质干细胞体外传代培养后细胞核型稳定 性水 崔冬冰，何志旭 ，李永念，王凤昌 （贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳５５０００４） ［摘 要］目的：研究脐带间充质干细胞（ＵＣ－ＭＳＣｓ）在经过培养和传代后是否会出现染色体异常改变。方法： 收集剖宫产足月胎儿脐带，采用胶原酶加胰酶消化法和机械法分离出ＵＣ．ＭＳＣｓ间充质干细胞贴壁培养传代，观 察细胞形态、免疫表型及细胞增殖实验等生物学特性，利用Ｇ显带分析原代（Ｖ０）和第３～６代（Ｐ３一ｐ６）细胞的染 色体核型。结果：染色体核型分析显示，ＰＯ和Ｐ３一Ｐ６ ｕｃ—ＭＳＣｓ均为正常二倍体核型，Ｇ显带未见染色体结构 异常；ＵＣ—ＭＳＣｓ呈成纤维样形态生长，Ｐ３一Ｐ６代高表达ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４，并且ＵＣ．ＭＳＣｓ在培养２～３ ｄ时达到 对数增长期。结论：ＵＣ—ＭＳＣｓ在体外连续传代培养６代以内染色体结构稳定，未出现染色体异常改变。 ［关键词］脐带；间充质干细胞；连续传代；核型分析；细胞，培养的 ［中图分类号］Ｒ３４９．５；Ｒ３４９．８９ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００－２７０７（２０１３）０５－０４４９－０５ Ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＵＩ Ｄｏｎｇｂｉｎｇ，ＨＥ Ｚｈｉｘｕ，ＬＩ Ｙｏｎｇｎｉａｎ，ＷＡＮＧ Ｆｅｎｇｃｈａｎｇ （Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｕｉｙａｎｇ Ｍｅｄｗａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４，Ｇｕ￣ｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＵＣ－ＭＳＣｓ）ｗｉｌｌ ｃｈａｎｇｅ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｓ ｏｆ ｃｅｓａｒｅａｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｓｅｐｔｉｃａｌｌｙ．ＵＣ—ＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｌｌａｇｅ－ ｎａｓｅ ａｎｄ ｔｙｒｐｓｉｎ ｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ａｎｄ ｋａｒｙｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐ０，Ｐ３， Ｐ４，Ｐ５，ａｎｄ Ｐ６ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｇ—ｂａｎｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｎｏｒｍａｌ ｄｉｐｌｏｉｄ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ４６ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｎｏ ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｈａｎｇｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＵＣ—ＭＳＣｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＣＤ７３，ＣＤ９０，ａｎｄ ＣＤ４４ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ Ｐ３～Ｐ６．Ｃｅｌｌｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ｉｎ ２—３ ｄａｙｓ ｏｆ ｃｕｈｕｒｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ： Ｗｈｅｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ６ ｐａｓｓａｇｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ＵＣ—ＭＳＣｓ ｃａｎ ｍａｉｎｔａｉｎ ｓｔａｂｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｗｈｉｃｈ ｐｍ— ｖｉｄｅｓ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＵＣ—ＭＳＣｓ ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ；ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｓｅｒｉｌａ ｐａｓｓａｇｅ；ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ；ｃｅｌｌ ｃｕｈｕｒｅｄ 间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， 有免疫原性低、易于分离培养、体外能大量扩增及 ＭＳＣｓ）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期 冻存等特点，近年已成为干细胞研究及应用的热 的中胚层和外胚层，是一种具有自我更新及多向分 点 。ＭＳＣｓ最初是在骨髓中被发现的，后来研究 化潜能的成体干细胞 －２］。ＭＳＣｓ不仅具有组织修 发现它还存在于脐带、脐血、胎盘和其他一些组织 复、免疫、支持造血等重要功能，而且同时还具 中，但在成人骨髓中的数量较少、容易被病毒感染 ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０５６０１５９），贵阳医学院院青年基金资助（Ｋ２００９—１５） 通信作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｚｘ＠ｇｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ ４４９ 贵阳医学院学报 ３８卷 及较强的免疫原性等因素了其临床应用。人 脐带来源的ＭＳＣｓ细胞含量、增殖能力都优于骨髓 ＭＳＣｓ，免疫原性比骨髓ＭＳＣｓ低，并且具有取材方 ＵＣ—ＭＳＣｓ的流式检测试剂盒，检测的阳性分子（包 括ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４）和阴性分子（只标记了一种 荧光染料，包括ＣＤ１ｌｂ、ＣＤＩ９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ— ＤＲ），以了解在细胞培养过程中ＭＳＣｓ细胞的纯度 便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到关 注 Ｊ。本研究通过Ｇ显带技术分析脐带间充质干 细胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ，ＵＣ－ 以及其分化情况。 １．３．３ ＭＳＣｓ细胞增殖实验采用ＭＩＴ法绘制人 ＭＳＣｓ）在体外连续传代培养至１Ｏ代，并对其中的 原代（记为Ｐｏ）和第３、４、５、６代细胞（分别记为 Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５和Ｐ６）进行染色体核型分析，以观察该 ＵＣ－ＭＳＣｓ的增殖曲线，将每一代细胞分别接种于 ９６孔板中，每块板接种１２孔细胞悬液２００ Ｌ，使 每孔细胞数量为５００—１ ０００，次１３更换培养液，培 细胞在体外传代培养过程中是否会出现核型改变。 １材料与方法 １．１标本来源 ’２例脐带取自贵阳仁爱医院产科健康足月新 生ＪＬＩＩ宫产手术后，经家属同意捐献所得，新生儿 性别为１男１女。 １．２材料 ＤＭＥＭ－低糖培养基（Ｇｉｂｃｏ公司）、ＦＢＳ（Ｈｙ－ ｃｌｏｎｅ公司）、Ⅱ型胶原酶（Ｇｉｂｃｏ公司）、胰蛋白 酶（Ｇｉｂｃｏ公司）、流式抗体试剂盒（ＢＤ公司）、 ＣＯ：细胞培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ公司）、流式细胞仪 （ＢＤ公司）、Ｌｅｉｃａ核型分析系统、染色体培养基、 秋水仙碱、甲醇、冰乙酸、、姬姆萨染液、细胞培养 瓶等。 １．３方法 １．３．１ ＭＳＣｓ分离培养在无菌条件下采集脐带， 在超净工作台中用无菌生理盐水（ＮＳ）清洗两遍， 置于７５％医用酒精中浸泡３０ Ｓ，取出后ＮＳ清洗两 遍，以充分洗净附着于脐带表面的酒精，减掉脐带 两端，将剩余组织剪成约３～５ ｃｍ的组织段，并剥 离华通式胶，转移入青霉素小瓶中用眼科剪将其剪 成２～３ ｍｍ长的组织条。然后采取两种方法分离 ＭＳＣｓ。（１）酶消化法分离培养ＭＳＣｓ：将剪碎的组 织中加入１０ ｍＬ Ｉ１型胶原酶置于３７ 水浴中消化 ２ ｈ，离心后弃去上清，加入０．２５％胰酶３７℃水浴 ３０ ｍｉｎ，离心后弃去上清，剩余组织和细胞中加入 含１０％ＦＢＳ的Ｌ—ＤＭＥＭ，并将其转移至细胞培养瓶 置于５％ＣＯ 培养箱中培养。（２）机械法分离培养 ＭＳＣｓ：在剪碎的组织中加入含１０％ＦＢＳ的Ｌ． ＤＭＥＭ，将其转移至培养瓶置于ＣＯ：培养箱中培 养。将分离得到的ＭＳＣｓ分为两部分，一部分冻存 于液氮，另一部分继续传代培养， １．３．２细胞鉴定流式抗体来自ＢＤ公司的人 ４５０ 养３天后取第一块９６孔板每孔中加入ｌＯ Ｌ的 ＭＴＩ＇，继续培养４ ｈ，吸出板中的液体，在每孔中加 入２００ Ｌ二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），８０ ｒ／ｍｉｎ震荡 ５ ｍｉｎ，使ＭＴＹ充分溶解，酶标仪检测ＯＤ值，连续 测量６ ｄ，并计算每天每代细胞的平均ＯＤ值，根据 每天的平均ＯＤ值绘制ＭＳＣｓ细胞增殖曲线。 １．３．４染色体核型根据流式检测和细胞增殖实 验结果，选择最佳培养代数和培养时间的细胞，加 入终浓度为０．０４ ｍｇ／Ｌ的秋水仙碱，于ＣＯ：培养 箱中继续培养４ ｈ，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。并 转移至１５ ｍＬ离心管中，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心８ ｍｉｎ， 弃上清，加入４ ｍＬ低渗液（０．０７５％ＫＣ１），３７℃水 浴５ ｍｉｎ，加入２ ｍＬ固定液（甲醇：冰乙酸＝３：１）再 ３７ ｃＣｌ水浴５ ｍｉｎ，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心８ ｍｉｎ，弃上清， 再次加入４ ｍＬ固定液再次离心，重复２次，重悬细 胞并滴片，室温条件下放置４８ ｈ后７５ ｏ【＝烤片４ ｈ， 姬姆萨染色１５ ｍｉｎ显代。 １．４观察指标 观察所培养的ＵＣ．ＭＳＣｓ细胞形态、免疫表型、 增殖情况及染色体核形。 ２ 结果 ２．１细胞形态 培养的ＵＣ－ＭＳＣｓ ７ ｄ左右贴壁，外形类似于成 纤维细胞，呈片状生长，细胞形态多样，以梭形为 主，可见多角形、星形等，传代后细胞增殖迅速，６ 代以内的细胞形态完整，呈长梭形流水状生长，细 胞形态良好，Ｐ７、Ｐ８代细胞形态良好但排列紊乱。 见图１。 ２．２免疫表型 Ｐ１、Ｐ２代细胞的阳性分子表达量较高，阴性分 子的表达量稳定在２％左右，Ｐ３一Ｐ６代细胞阴性 分子的表达量比例均在２％以下，Ｐ７和Ｐ８代细胞 阴性分子的表达量＞４％。见图２。 ５期 胡慧等水环境中兔肝粉和葵花籽粉对贵阳腐霉的影响 富的蛋白质，能为贵阳腐霉生长提供所需的营养， 高，但毒力却是以蛋白胨为氮源时培养的真菌毒力 贵阳腐霉菌丝体极易在其中生长 。所以在一定 最强。因而，产孢量大的菌株毒力也不一定强，这 范围内当水中兔肝粉或葵花籽粉含量增高时，水体 可能与游动孢子本身的活力有关。也即是说，即使 中的贵阳腐霉菌丝生长较好。在灭蚊实验中也发 游动孢子的量多，但是如果质量不高，活力差，在侵 现，蚊虫感染率高的水杯中，兔肝粉和葵花籽粉集 染宿主时游动孢子附着能力弱，那么也就不可能对 结成块，在低倍镜下可见粗壮的纵横交错的贵阳腐 蚊幼虫产生高效致病性。 霉菌丝体，其结果增加了贵阳腐霉的实际“剂量”。 本实验中观察到贵阳腐霉在水中葵花籽粉或 这一点和苏晓庆对大链壶菌的研究相似 Ｊ。 兔肝粉颗粒中腐生繁殖，提示贵阳腐霉可以在蚊虫 本实验发现水体中加人兔肝粉和葵花籽粉虽 孳生地的有机物中生长、定植，为其在野外灭蚊作 能促进贵阳腐霉菌丝生长，但却减少贵阳腐霉游动 用持续的特点及实用价值提供依据。同时在进行 孢子的释放量。因为水中营养物质的浓度可以影 以贵阳腐霉为基础的生物灭蚊剂的剂型设计中可 响真菌释放游动孢子，高营养的环境可以抑制游动 以考虑采用兔肝粉、葵花籽粉等作为添加剂，使其 孢子的释放 Ｊ。本实验结果提示当水体中加入少 可以对贵阳腐霉提供营养支撑。 量（０．０４ ｇ／Ｌ）兔肝粉或葵花籽粉时，蚊虫死亡率明 显增加；但当水中兔肝粉或葵花籽粉量达０．Ｏ８ ｇ／Ｌ ４参考文献 及以上时，蚊虫死亡率即下降。其原因可能是过量 的兔肝粉和（或）葵花籽粉导致水体的有机污染， ［１］Ｈｕａｎｇ ＳＷ，Ｓｕ ＸＱ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｕｉｙａｎ－ 该污染达到一定程度，可能会抑制贵阳腐霉游动孢 ｇｅｎｓｅ，ａ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｌａｒｖａｅ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｙｓ－ 子的数量，降低其活力，从而抑制贵阳腐霉的灭蚊作 ｔｅｍａ，２００７（３）：３８０—３８８． 用。苏晓庆 对大链壶菌的研究也发现，每１００ ｍＬ ［２］杨月欣．中国食物成分表２００４（第二册）［Ｍ］．北京：北 水中加入６．４ ｍｇ葵花籽粉或６ ｍｇ兔肝粉时分别可 京大学医学出版社，２００５：７—１４． 使蚊虫感染率增加２倍和３倍；同样，过多的兔肝粉 ［３］苏晓庆，郭庆．水环境中的几种物质对大链壶菌灭蚊效率 影响的初步研究［Ｊ］．菌物学报，１９９４（２）：１１１—１２０． 或葵花籽粉也会抑制大链壶菌的灭蚊作用。Ｊａｒｏｎ— ［４］苏晓庆，黄江海，夏嫱．灭蚊真菌贵阳腐霉孢子囊和 ｓｋｉ ａｎｄ Ａｘｔｅｌｌ 在对大链壶菌的研究中发现，在低 游动孢子形成的观察［Ｊ］．菌物学报，２０１３（增刊）：２４４ 或中等有机污染的水中，大链壶菌基本上丧失了对 —２４８． 蚊虫的感染毒力，其原因可能是有机污染抑制了大 ［５］Ｊａｒｏｎｓｋｉ，ＳＴ，Ａｘｔｅｌｌ ＲＣ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｗａｔｅｒ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ 链壶菌菌丝体的生长及游动孢子的形成。 ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｌａｇｅｎｉｄｉｕｍ ｉｇｇａｎｔｅｕｍ ｆ ０ｏ・ 综合本实验中兔肝粉与葵花籽粉对贵阳腐霉 ｍｙｃｅｔｅｓ：Ｌａｇｅｎｉｄｉｌａｅｓ）ｆｏｒ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｃｉａｔｕｓ 产孢量和灭蚊能力的影响发现，当水体中加入少量 （Ｄｉｐｅｒａ：Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）：ｆｉｅｌｄ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｊ］． 兔肝粉或葵花籽粉时，减少了贵阳腐霉的产孢量， Ｍｅｄ．Ｅｎｔｏｍｏｌ，１９８２（３）：２５５—２６２． 但蚊虫死亡率却明显增加。黄盛文¨ 对贵阳腐霉 （２０１３－０７－２４收稿，２０１３－－０８－２０修回） 编辑：潘娅 生物学特性的研究中也发现灭蚊能力与游动孢子 数量分歧的现象。以酵母浸膏为氮源时产孢量最 （上接第４５３页） ［２］Ａｍｆｅ ＭＣ，Ｄｅｌａ ＦＡ，Ｆｕｅｎｔｅｓ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ａｓ ａ 干细胞染色体核型的稳定性［Ｊ］．军事医学，２０ｌ２（８）： ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｊｏｉｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ ５９９—２０２． ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ，２０１１（６）：４３—５Ｏ． ［６］Ｆｏｔｉｎｏ ｃ，Ｒｉｃｏｒｄｉ Ｃ，Ｌａｕｒｉｏｌａ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅ— ［３］Ｓｔｅｗａｒｔ ＭＣ，Ｓｔｅｗａｒｔ ＡＡ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｒ－ ｉｒｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ・ ａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖｅｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ Ｄｉａｂｅｔ Ｓｔｕｄｙ，２０１０（２）：１４４ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔ，２０１ｌ（２）：２４３—２６１． —１５７． ［４］Ｒｉｎｇｄｅｎ Ｏ，Ｌｅ Ｂｌａｎｃ Ｋ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔ－ ［７］阮光萍，潘兴华，邓永丽，等．人脐带间充质干细胞传代 ｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ—ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ｔｉｓｓｕｅ 后发生染色体核型变异［Ｊ］．中国优生与遗传杂志， ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａ－ ２０１２（１Ｏ）：４２—４＿４． ｔｏｌ，２０１ｌ（１）：６５—７２． （２０１３－０７—１６收稿，２０１３－０８－２０修回） ［５］王军，徐曼，盛宏霞，等．体外连续传代培养脐带间充质 编辑：文箐颍 ４５７
