(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111007251 A(43)申请公布日 2020.04.14
(21)申请号 201911341144.2(22)申请日 2019.12.23
(71)申请人 中国检验检疫科学研究院
地址 100176 北京市大兴区经济技术开发
区荣华南路11号
申请人 吉尔生物科技(天津)有限公司(72)发明人 刘键 段德民 张永江 (74)专利代理机构 北京冠榆知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 11666
代理人 朱亚琦(51)Int.Cl.
G01N 33/577(2006.01)G01N 33/569(2006.01)G01N 33/558(2006.01)
权利要求书2页 说明书7页 附图5页
(54)发明名称
纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法(57)摘要
本发明公开纳米酶试纸条检测诺如病毒的
(1)纳米酶的合成；(2)纳米方法，包括如下步骤：
酶-诺如抗体探针的制备；(3)纳米酶免疫层析试纸条的组装；(4)纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒的检测。本申请的纳米酶免疫层析试纸条的检测的灵敏度比胶体金试纸条可提高10倍，纳米酶免疫层析试纸条对诺如病原体检测的敏感性高、可靠性高，且对诺如病毒具有特异性识别。本申请的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法兼具胶体金技术的简便、快速、可现场应用的优点，又具有高灵敏度的特性，具有广阔的发展前景。
CN 111007251 ACN 111007251 A
权 利 要 求 书
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1.纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)纳米酶的合成；
(2)纳米酶-诺如抗体探针的制备；(3)纳米酶免疫层析试纸条的组装；
(4)纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒的检测。
2.根据权利要求1所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用水热法合成纳米酶：将FeCl 3·6H2O溶解于乙二醇中，搅拌溶解，再加入醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜中，进行反应，得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗，然后用电热恒温干燥箱烘干保存，得到纳米酶。
3.根据权利要求2所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用水热法合成纳米酶：将FeCl 3·6H2O溶解于乙二醇中，搅拌溶解，再加入一定量的醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜中，200℃反应14小时，得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗3次，然后用电热恒温干燥箱烘干保存，得到纳米酶。
4.根据权利要求1所述的的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(2)中，
(2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶，用去离子水洗涤；(2-2)离心后，弃上清液；沉淀用MES缓冲溶液重悬，同时加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混匀后，置于摇床内活化；
(2-3)活化后，用MES缓冲溶液洗涤，然后用MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米酶；(2-4)诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜孵育；(2-5)加入Tris缓冲液，终止反应；(2-6)磁分离后，用5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米酶-诺如抗体探针。5.根据权利要求4所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(2)中，
(2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶500μL，纳米酶的浓度为5mg/mL，用1mL去离子水洗涤三次；
(2-2)离心后，弃上清液；沉淀用1mL的MES缓冲溶液重悬，MES缓冲溶液的pH为6.0，同时加入20μL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50μL的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混匀后，置于摇床内活化30min；EDC的浓度为0.4mol/L，NHS的浓度为0.1mol/L；摇床的转速为70rpm；
(2-3)活化后，用1mL的MES缓冲溶液洗涤一次，然后用500μL的MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米酶；
(2-4)取50μg的诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜孵育，孵育温度为4℃；
(2-5)用Tris缓冲液在室温下孵育30min，终止反应；Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
(2-6)磁分离后，用0.5mL的5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米酶-诺如抗体探针。6.根据权利要求1所述的的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(3)中，包括如下步骤：
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权 利 要 求 书
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(3-1)在硝酸纤维素膜(4)上划质控线C线和检测线T线：用浓度为1mg/mL的羊抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线；用浓度为2mg/mL的鼠源诺如单抗在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，划线参数为0.1μL/mm，质控线和检测线之间的距离为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜(4)置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃；
(3-2)：在结合垫(3)上喷涂纳米酶-诺如抗体探针：将偶联好的纳米酶-诺如探针用1％BSA-Tris缓冲液稀释，配制得到纳米酶-诺如探针的浓度为1mg/mL；将稀释的纳米酶-诺如探针喷涂至结合垫(3)上，喷涂参数为0.5μL/mm；然后将结合垫(3)置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃；
(3-3)：组装试纸条：将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)依次贴在底卡(1)上，并且使硝酸纤维素膜(4)上的检测线靠近结合垫(3)，使硝酸纤维素膜(4)上的质控线靠近吸收垫(5)；样品垫(2)和结合垫(3)均为玻璃纤维膜，吸收垫(5)为吸水滤纸；组装成完整的纳米酶免疫层析试纸条，然后采用切条机切成宽度为4mm的试纸条；
(3-4)在每一个纳米酶免疫层析试纸条上加盖上卡壳(6)，且卡壳(6)上开设有加样孔(6-1)和显色孔(6-2)；加样孔(6-2)盖在样品垫(2)上，显色孔(6-2)盖在硝酸纤维素膜(4)上，并且使质控线和检测线位于显色孔(6-2)内，完成纳米酶免疫层析试纸条的组装后，将组装好的纳米酶免疫层析试纸条置于密封袋中室温干燥保存。
7.根据权利要求1所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(4)中，包括如下步骤：
(4-1)取出纳米酶免疫层析试纸条，在加样孔(6-2)中加入100μL诺如抗原液，开始层析检测，计时10分钟；层析后，在纳米酶免疫层析试纸条的显色孔(6-2)内，加入1mL的纳米酶底物显色液，使纳米酶底物显色液的填满显色孔(6-2)，避光显色5-10分钟；纳米酶底物显色液为二氨基联苯胺DAB与双氧水；
(4-2)避光显色5-10分钟时，用移液枪从加样孔(6-2)中吸走纳米酶底物显色液，然后观察纳米酶免疫层析试纸条上的质控线和检测线的颜色信号，判断检测结果，超过15分钟结果无效。
8.根据权利要求7所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，判断检测结果的方法为：如果纳米酶免疫层析试纸条同时出现质控线和检测线，则检测结果为阳性，即待测样品中有诺如病毒；如果诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现质控线，检测结果为阴性，即待测样品中没有诺如病毒；如果诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现检测线，则检测结果无效，需重新检测。
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说 明 书
纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法
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技术领域
[0001]本发明涉及诺如病毒检测技术领域。具体地说是纳米酶试纸条检测诺如 病毒的方法。
背景技术
[0002]诺如病毒(又称诺瓦克病毒，Norwalk Viruses)，是杯状病毒科家族中 的一员，是引起人类病毒性肠胃炎的主要原因之一，约占全世界腹泻病例的 18％。在发达国家，诺如病毒被认为是儿童和成人非细菌性腹泻爆发的最常 见原因，仅在美国每年就造成约1900-2100万人患病，56000-71000人住 院，570-800人死亡。虽然轮状病毒被认为是发展中国家儿童腹泻的主要原 因，在已将轮状病毒疫苗纳入免疫规划的国家，诺如病毒正迅速成为儿童严 重肠胃炎最常见的病原。最近的一项研究认为，发展中国家有20多万儿童 死于诺如病毒。
[0003]
由此可见，诺如病毒仍具有一定的传染性和危害性，目前，对诺如病毒 的检测主
要核酸检测和ELISA、胶体金等方法，当核酸检测和ELISA方法 技术繁杂，需要专业技术人员操作，胶体金试纸条灵敏度底，因此研制出诺 如病毒快速灵敏的检测方法非常必要。[0005]诺如病毒为无包膜单股正链RNA病毒，变异速度快，每隔2-3年即可出 现引起全球流行的新变异株，环境抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、 排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样、全人群普遍易感，因此， 诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力。诺如病毒感染发病的主要表现为 腹泻和/或呕吐，国际上通常称之为急性胃肠炎。我国一直将其列入丙类传 染病中“其他感染性腹泻病”进行报告管理，这在一定程度上影响了以呕吐 为主要症状的诺如病毒感染病例及其暴发的报告。再加上诺如病毒具有自愈 性，所以，很多医院都不检查诺如病毒，这样就忽视了对诺如病的监控。诺 如病毒是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原，疾病负担严重。 因此，应加强对诺如病毒的检测和控制。
[0006]在检测方面，诺如病毒无蛋白包膜，目前没法进行体外培养，限制了病 毒的分离和血清型分型鉴定。只有靠生化方法和分子生物学方法进行鉴定。[0007]目前的主要检测方法有：[0008]1.核酸检测和基因型鉴定，主要有Real-time RT-PCR和传统PCR，准 确度相对高，但过程繁琐，需要专门的仪器设备和专业技术人员。[0009]2.抗原检测
[0010]抗原检测主要有ELISA方法，也已开发出大批的商品化试剂盒，可适用 于暴发疫情中大量样本的筛查，但ELISA试剂盒成本高、敏感性低，需要专 业技术人员操作，不够简便快捷。胶体金检测，是目前市场上最为普遍的快 捷检测，但灵敏度相对较低。目前，也逐渐有纳米金等免疫层析方法的研究。 以寻求简便快捷高灵敏度的检测方法。
[0004]
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说 明 书
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发明内容
[0011]为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测灵敏度高、操作简 便的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法。[0012]为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：[0013]纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，包括如下步骤：[0014](1)纳米酶的合成；[0015](2)纳米酶-诺如抗体探针的制备；[0016](3)纳米酶免疫层析试纸条的组装；[0017](4)纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒的检测。[0018]上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，在步骤(1)中，采用水热法 合成纳米酶：将FeCl3·6H2O溶解于乙二醇中，搅拌溶解，再加入醋酸钠， 待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜中，进行反应，得到的产物磁分离， 弃上清，沉淀用乙醇清洗，然后用电热恒温干燥箱烘干保存，得到纳米酶。
[0019]上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，在步骤(1)中，采用水热法 合成纳米酶：将FeCl3·6H2O溶解于乙二醇中，搅拌溶解，再加入一定量 的醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜中，200℃反应14小时， 得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗3次，然后用电热恒温干燥箱 烘干保存，得到纳米酶。[0020]上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，在步骤(2)中，[0021](2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶，用去离子水洗涤；[0022](2-2)离心后，弃上清液；沉淀用MES缓冲溶液重悬，同时加入EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰 亚胺)，混匀后，置于摇床内活化；[0023](2-3)活化后，用MES缓冲溶液洗涤，然后用MES缓冲溶液重悬， 得到活化的纳米酶；[0024](2-4)诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜孵育；[0025](2-5)加入Tris缓冲液，终止反应；[0026](2-6)磁分离后，用5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米酶-诺如 抗体探针。[0027]上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，在步骤(2)中，[0028](2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶500μL，纳米酶的浓度为5mg/mL， 用1mL去离子水洗涤三次；[0029](2-2)离心后，弃上清液；沉淀用1mL的MES缓冲溶液重悬，MES缓 冲溶液的pH为6.0，同时加入20μL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐)和50μL的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混匀后，置于 摇床内活化30min；EDC的浓度为0.4mol/L，NHS的浓度为0.1mol/L；摇床 的转速为70rpm；[0030](2-3)活化后，用1mL的MES缓冲溶液洗涤一次，然后用500μL的 MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米酶；[0031](2-4)取50μg的诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜 孵育，孵育温度为4℃；[0032](2-5)用Tris缓冲液在室温下孵育30min，终止反应；Tris缓冲液 的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
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(2-6)磁分离后，用0.5mL的5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米 酶-诺如抗体探
针。
上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，在步骤(3)中，包括如下步 骤：
[0035](3-1)在硝酸纤维素膜(4)上划质控线C线和检测线T线：用浓度 为1mg/mL的羊抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线；用浓度为 2mg/mL的鼠源诺如单抗在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，划线参数为0.1 μL/mm，质控线和检测线之间的距离为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜(4) 置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃；[0036](3-2)：在结合垫(3)上喷涂纳米酶-诺如抗体探针：将偶联好的纳 米酶-诺如探针用1％BSA-Tris缓冲液稀释，配制得到纳米酶-诺如探针的浓 度为1mg/mL；将稀释的纳米酶-诺如探针喷涂至结合垫(3)上，喷涂参数 为0.5μL/mm；然后将结合垫(3)置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃；[0037](3-3)：组装试纸条：将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4) 和吸收垫(5)依次贴在底卡(1)上，并且使硝酸纤维素膜(4)上的检测 线靠近结合垫(3)，使硝酸纤维素膜(4)上的质控线靠近吸收垫(5)；样 品垫(2)和结合垫(3)均为玻璃纤维膜，吸收垫(5)为吸水滤纸；组装 成完整的纳米酶免疫层析试纸条，然后采用切条机切成宽度为4mm的试纸 条；[0038](3-4)在每一个纳米酶免疫层析试纸条上加盖上卡壳(6)，且卡壳 (6)上开设有加样孔(6-1)和显色孔(6-2)；加样孔(6-2)盖在样品垫 (2)上，显色孔(6-2)盖在硝酸纤维素膜(4)上，并且使质控线和检测 线位于显色孔(6-2)内，完成纳米酶免疫层析试纸条的组装后，将组装好 的纳米酶免疫层析试纸条置于密封袋中室温干燥保存。[0039]上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，在步骤(4)中，包括如下步 骤：[0040](4-1)取出纳米酶免疫层析试纸条，在加样孔(6-2)中加入100μL 诺如抗原液，开始层析检测，计时10分钟；层析后，在纳米酶免疫层析试 纸条的显色孔(6-2)内，加入1mL的纳米酶底物显色液，使纳米酶底物显 色液的填满显色孔(6-2)，避光显色5-10分钟；纳米酶底物显色液为二氨 基联苯胺DAB与双氧水；[0041](4-2)避光显色5-10分钟时，用移液枪从加样孔(6-2)中吸走纳 米酶底物显色液，然后观察纳米酶免疫层析试纸条上的质控线和检测线的颜 色信号，判断检测结果，超过15分钟结果无效。
[0042]上述纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，判断检测结果的方法为：如果 纳米酶免疫层析试纸条同时出现质控线和检测线，则检测结果为阳性，即待 测样品中有诺如病毒；如果诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现质控线， 检测结果为阴性，即待测样品中没有诺如病毒；如果诺如病毒纳米酶免疫层 析试纸条只出现检测线，则检测结果无效，需重新检测。
[0043]本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：[0044]本申请运用免疫层析技术，以诺如病毒为检测样本，利用纳米酶具有过 氧化物酶催化活性的特点，将传统的胶体金替换为纳米酶，研究纳米酶免疫 层析试纸条在诺如病毒检测中的应用，通过在免疫层析后加入酶的催化底物 DAB，可显著增强检测信号，达到更高检测灵敏度的效果。本申请的纳米酶 免疫层析试纸条的检测的灵敏度比胶体金法可提高10倍，纳米酶免疫层析 试纸条对诺如病原体检测的敏感性高、可靠性高，且对诺如病毒具
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有特异性 识别。本申请的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法兼具胶体金技术的简便、 快速、可现场应用的优点，又具有高灵敏度的特性，具有广阔的发展前景。附图说明
[0045]图1本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的纳米酶免疫层析试纸 条结构示意图；
[0046]图2本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的纳米酶免疫层析试纸 条加盖卡壳的结构示意图；
[0047]图3本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的纳米酶免疫层析试纸 条的检测原理图；
[0048]图4本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的纳米酶的透射电子显 微镜表征图；
[0049]图5本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的纳米酶的动态光散射 表征图；[0050]图6本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的纳米酶材料的酶催化 活性表征图；
[0051]图7发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法层析10min后的检测图；[0052]图8发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法显色5min后的检测图；[0053]图9本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的检测不同浓度的诺如 抗原的检测结果图；
[0054]图10胶体金试纸条检测不同浓度的诺如抗原的检测结果图；
[0055]图11本发明纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法的特异性检测结果图，1 为轮状病毒，2为线状病毒，3为幽门螺杆菌，4为诺如病毒。[0056]图中附图标记表示为：1-底卡；2-样品垫；3-结合垫；4-硝酸纤维素膜； 5-吸收垫；6-卡壳；6-1-加样孔；6-2-显色孔。具体实施方式
[0057]本实施例的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，包括如下步骤；[0058]1、纳米酶的合成；
[0059]采用水热法合成纳米酶：将0.3g FeCl3·6H2O溶解于20mL乙二醇中， 搅拌溶解，再加入1.5g醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜 中，200℃反应14小时，得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗3次， 然后用电热恒温干燥箱50-60℃烘干保存，得到纳米酶。
[0060]其中：醋酸钠、FeCl3·6H2O、乙醇、乙二醇购自北京化学试剂厂；高温 烘箱购自天津泰斯特。
[0061]纳米酶的表征：将所制备的纳米酶用透射电子显微镜(JEOL 2000FX 200KV，日本电子公司)和动态光散射仪表征。所制备的纳米酶材料粒径均 一性非常高：如图4所示，透射电子显微镜表征其粒径为110±10nm，如图 5所示，动态光散射表征其水合粒径为130nm左右，这是因为在纳米酶材料 外围形成了水化层而造成其粒径略有增大。[0062]纳米酶的酶活力测定：用酶标仪测试所制备纳米酶材料的酶催化活性， 并通过分
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光光度仪测定所制备纳米酶材料的酶活力。[0063]如图6所示：利用酶标仪对纳米酶材料的酶催化活性进行测试分析，发 现所制备的纳米酶材料的过氧化物酶催化活性很好，在催化反应10min时， 即可达到活性最高值。[0064]通过分光光度仪测定所制备纳米酶材料的比活性，检测和计算方法依据 Jiang等发表的纳米酶比活性标准化文章所得(Standardized assays for determining the catalytic activity and kinetics of peroxidase-like nanozymes，Nat Protoc,2018.13(7):p.1506-1520.)，经计算，所制备 纳米酶材料的比活性为9.33U/mg。[0065]2、纳米酶-诺如抗体探针的制备[0066](2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶500μL，纳米酶的浓度为5mg/mL， 用1mL去离子水洗涤三次；[0067](2-2)离心后，弃上清液；沉淀用1mL的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓 冲溶液重悬，MES缓冲溶液的pH为6.0，同时加入20μL的EDC(1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50μL的NHS(N-羟基琥珀酰亚 胺)，混匀后，置于摇床内活化30min；EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐)的浓度为0.4mol/L，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度 为0.1mol/L；摇床的转速为70rpm；[0068](2-3)活化后，用1mL的MES缓冲溶液洗涤一次，然后用500μL的MES 缓冲溶液重悬，得到活化的纳米酶；[0069](2-4)取50μg的诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜孵育， 孵育温度为4℃；[0070](2-5)用Tris缓冲液在室温下孵育30min，终止反应；Tris缓冲液的浓 度为0.05mol/L，pH为7.2；[0071](2-6)磁分离后，用0.5mL的5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米酶- 诺如抗体探针。
[0072]其中：EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐， 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride)，购 自Sigma-Aldrich公司；
[0073]NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，N-Hydroxysuccinimide，购自 (Sigma-Aldrich)[0074]诺如病毒鼠单克隆抗体购自BIOCare公司，酶联免疫分析仪购自Bio- Rad。[0075]3、纳米酶免疫层析试纸条的组装；如图1和图2所示：[0076](3-1)在硝酸纤维素膜4上划质控线C线和检测线T线：用浓度为1mg/mL的羊抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线；用浓度为2mg/mL 的鼠源诺如单抗在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，划线参数为0.1μL/mm， 质控线和检测线之间的距离为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜4置于恒温箱 中干燥1h，干燥温度为40℃；[0077](3-2)：在结合垫3上喷涂纳米酶-诺如抗体探针：将偶联好的纳米酶- 诺如探针稀释到1％BSA-Tris缓冲液中，配制得到纳米酶-诺如探针的浓度为 1mg/mL；将稀释的纳米酶-诺如探针喷涂至结合垫3上，喷涂参数为0.5μ L/mm；然后将结合垫3置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃；[0078](3-3)：组装试纸条：将样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫 5依次贴在底卡1上，并且使硝酸纤维素膜4上的检测线靠近结合垫3，使 硝酸纤维素膜4上的质控线靠近
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吸收垫5；样品垫2和结合垫3均为玻璃纤 维膜，吸收垫5为吸水滤纸；组装成完整的纳米酶免疫层析试纸条，然后采 用切条机切成宽度为4mm的试纸条；[0079](3-4)在每一个纳米酶免疫层析试纸条上加盖上卡壳6，且卡壳6上开 设有加样孔6-1和显色孔6-2；加样孔6-2盖在样品垫2上，显色孔6-2盖 在硝酸纤维素膜4上，并且使质控线和检测线位于显色孔6-2内，完成纳米 酶免疫层析试纸条的组装后，将组装好的纳米酶免疫层析试纸条置于密封袋 中室温干燥保存。[0080]其中：PVDF膜(Millipore)，割流喷膜划线机(Arista，USA)，切条 机(天津科炬生物)，XYZ三维划膜喷金仪(上海金标)。[0081]4、纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒的检测：[0082]4.1、检测原理：如图3所示，用纳米酶磁颗粒代替胶体金，使之与诺 如病毒标记抗体偶联，从而构建纳米酶-抗体探针。当纳米酶-抗体探针与样 品中的诺如病原体结合后，层析至试纸条的检测线(T线，喷涂有诺如病毒 的捕获抗体)与对照线(C线，喷涂有羊抗鼠抗体)时，纳米酶-抗体探针与 诺如病原体的复合物就会与T线处的捕获抗体、C线处的羊抗鼠抗体结合， 从而在T线与C线处形成纳米酶颗粒的聚集，这时加入过氧化物酶的底物如 DAB，利用纳米酶的酶活性，就会催化DAB发生化学反应生成大量棕褐色的 沉淀，放大检测信号，从而实现诺如病毒的快速敏感检测。[0083]4.2、具体检测方法为：[0084](4-1)将诺如抗原浓度稀释至0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、 50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml。[0085](4-2)取出纳米酶免疫层析试纸条，在加样孔6-2中加入100μL步骤 (4-1)中不同浓度的诺如抗原液，开始层析检测，计时10分钟；层析后在 纳米酶免疫层析试纸条的显色孔6-2内，加入1mL的纳米酶底物显色液，使 纳米酶底物显色液的填满显色孔6-2，避光显色5-10分钟；纳米酶底物显 色液为二氨基联苯胺DAB与双氧水；[0086](4-3)避光显色5-10分钟时，用移液枪从加样孔6-2中吸走纳米酶底 物显色液，然后观察纳米酶免疫层析试纸条上的质控线和检测线的颜色信号， 判断检测结果，超过15分钟结果无效。
[0087]如图7和图8所示：纳米酶免疫层析试纸条加入过氧化物酶底物DAB后， 显色效果明显增加，显色前(层析10min)，肉眼可视检测灵敏度为50ng/mL， 显色后肉眼可视检测灵敏度为5ng/mL。说明纳米酶确实能催化过氧化物酶 底物DAB发生颜色反应，产生可视信号，从而增强层析试纸条的检测效果。[0088]4.3、对比纳米酶试纸条与胶体金试纸条的检测灵敏度
[0089]胶体金试纸条的检测方法同纳米酶试纸条检测方法相同。如图9和图 10所示：在八个诺如抗原浓度检测梯度中，纳米酶免疫层析试纸条的最低 抗原检测浓度是5ng/mL，而商业化胶体金试纸条的最低抗原检测浓度是 50ng/mL，纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒抗原的检测灵敏度提高了约10 倍。[0090]4.4、纳米酶免疫层析试纸条特异性检测
[0091]为验证诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒检测的特异性，本实 施例检测了轮状病毒、线状病毒和幽门螺杆菌，如图11所示，发现所制备 的诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条仅能特异性检出诺如病毒，说明所制备的 纳米酶试纸条对诺如病毒的检测特
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异性非常好。[0092]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式 的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做 出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。 而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保 护范围之中。
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