直肠癌新辅助治疗中放射性肠损伤相关基因生物信息学分析

临床研究直肠癌新辅助治疗中放射性肠损伤相关基因生物信息学分析

黄俊鹏，林贵山，戴永美，陈静波，蒋桂成，崔同建 （福建省立医院 肿瘤内科，福州 350001）

[摘要]目的 探究直肠正常组织放射性损伤相关基因并讨论其潜在的作用机制。方法 利用基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)的GSE15781中直肠癌旁正常组织样本表达谱芯片组，通过limma包比较正常直肠组织在放疗前后的差异基因，接着对差异基因进行功能富集分析和构建蛋白相互作用网络发现放射性损伤相关的作用机制。结果 筛选出正常直肠组织在放疗前后的122个差异基因，其中上调基因86个，下调基因36个。基因本体(gene ontology, GO)富集分析显示差异基因参与改变直肠组织对类固醇激素、糖皮质激素、皮质类固醇反应，多种免疫细胞(单核细胞、髓样细胞、白细胞)趋化和迁移等生物学行为变化；影响DNA结合转录激活因子活性、氧化还原酶活性和受体配体活性等分子功能。京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析显示差异基因介导TNF信号通路等，与直肠放射性损伤存在一定相关性。蛋白相互作用网络则提示IL6、FOS、JUN、CCL2、PTGS2等基因在直肠放射性损失中发挥关键作用。结论 本研究发现直肠癌旁正常组织放疗后IL6、FOS、JUN、CCL2等基因失调，从而改变直肠黏膜炎症及免疫细胞浸润并介导TNF信号通路，从而在直肠放射性损伤中发挥重要作用。

[关键词]直肠癌旁组织；放射性损伤；基因DOI：10.16746/j.cnki.11-9332/r.2019.02.004

Bioinformatics analysis of genes related to radiation-induced intestinal injury in neoadjuvant therapy for rectal cancer

HUANG Jun-peng, LIN Gui-shan, DAI Yong-mei, CHEN Jing-bo, JIANG Gui-cheng, CUI Tong-jian (Department of Medical Oncology, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, China)

[Abstract] Objective To explore the genes related to radiation damage in normal rectal tissues and discover its potential mechanism of action. Methods The gene expression spectrum chip of GSE15781 in the Gene Expression Omnibus (GEO) database was used, and the differential gene expressions of normal rectal tissue before and after radiotherapy were compared by limma package, followed by functional enrichment analysis of differential genes and construction of protein interaction network so as to discover the mechanism of action of radiation damage. Results We screened 122 differential genes in normal rectal tissues before and after radiotherapy, including 86 up-regulated genes and 36 down-regulated genes. Gene ontology enrichment analysis showed that differential genes were involved in changing rectal tissue response to steroid hormones, glucocorticoids, corticosteroids as well as chemotactic migration of various immune cells (monocytes, myeloid cells, leukocytes) , and affecting molecular functions such as DNA-binding transcriptional activator activity, oxidoreductase activity, and receptor ligand activity. KEGG (Kyoto Encyclopedia

基金项目：2018福建省卫生计生中青年骨干人才培养项目(No. 2018-ZQN-5)通信作者：崔同建，Email：fjslctj@163.com

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创伤与急诊电子杂志 2019年4月 第7卷 第2期 J TRAUMA EMERG ，Apr.2019，vol.7，No.2of Genes and Genomes) pathway enrichment analysis showed that differential gene mediated TNF signaling pathway and had a certain correlation with rectal radiation injury. Protein interaction networks suggest that genes such as IL6, FOS, JUN, CCL2, and PTGS2 play key roles in rectal radioactivity loss. Conclusions This study reveals that IL6, FOS, JUN, CCL2 gene imbalance in normal tissues adjacent to rectal cancer after radiotherapy can alter rectal mucosal inflammation and immune cell infiltration and mediate TNF signaling pathway. Thus, it plays an important role in the rectal radiation injury.

[Key words] Rectal paracancerous tissue; Radioactive injury; Gene

国际癌症研究机构GLOBOCAN2018预计全球恶

性肿瘤新发病例1810万，死亡病例960万[1]。外照射放射治疗（以下简称“放疗”）是各种癌症重要的治疗方式之一。根据2008年世界卫生组织的统计，目前恶性肿瘤5年的生存率为55%，其中手术贡献率为25%，放疗贡献率为22%，化疗贡献率为6%[2]。而用于放疗总费用仅占癌症支出总额的5%左右，由此可见放疗是一种经济有效的治疗方法[3]。随着现代技术在定位、计划制定和人工智能等方面迅猛发展，使得放疗实施更加精准，在国内也得到更广泛应用，在过去十年中有所增加。

而对于盆腔恶性肿瘤，包括直肠癌、宫颈癌和前列腺癌等[4]，放疗引起的肠道放射性损伤是一个重要问题。首先，肠道放射性损伤与患者经济负担和生活质量密切相关；其次，它限制了可用于控制癌症的放疗剂量，因为与放射治疗相关的副作用往往限制了患者的耐受性。由于急性黏膜损伤和梗塞，放射损伤可在放射治疗期间或放射治疗后不久出现，或由于经壁纤维化和血管硬化的慢性过程，放射治疗后数月或数年内出现[5]。

然而目前关于放射性肠损伤相关机制仍知之甚少[6]，本研究将通过比较直肠癌旁正常组织在放疗前后的差异基因，对差异基因进行功能富集分析、构建蛋白相互作用网络探讨放射性损伤相关的作用机制。有助于进一步认识放射性肠损伤的作用靶点和机理，为后续预测和治疗放射性肠损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因表达谱数据的获取 从基因表达数据库

(gene expression omnibus, GEO)下载编号为GSE15781局部晚期直肠癌和癌旁正常组织放疗前和放疗后的基因表达谱芯片，该芯片基于GPL2986平台ABI human genome survey microarray version 2检测。接着提取该芯片内10对放疗前和放疗后的癌旁正常直肠

组织基因表达谱数据用于后续分析放射性肠损伤相关基因。

1.2 基因差异表达分析 首先，基于GPL2986平台

注释文件，利用Perl软件对芯片探针ID进行重注释转换为基因名(gene symbol)，对于多个探针ID对应同一个基因，取均值作为其表达值；其次，利用R软件(Vertion 3.5.3 from https://www.r-project.org/)中的limma包normalizeBetweenArrays函数归一化芯片表达强度，使得强度在一组阵列上具有相似的分布；最后利用eBayes函数检测差异表达，根据基因表达变化倍数及P值(截断值：|fold-change, FC|>2 & P<0.05)筛选出癌旁正常直肠组织放疗前和放疗后的差异表达基因并绘制火山图、热图，对差异基因进行可视化。

1.3 差异基因富集分析 利用R软件的org.Hs.eg.db

包对上一步筛选出的差异基因进行基因本体(gene ontology, GO)富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析有助于发现差异基因参与的相关生物学过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)以及分子功能(molecular function, MF)。KEGG通路富集分析则可探究差异基因参与调控的信号通路，接着利用Pathview包对得到的KEGG调控通路进行可视化 (P<0.05)。

1.4 蛋白互相作用网络构建 将差异基因导入

STRING (https://string-db.org/)网站进行蛋白与蛋白相互作用网络构建(protein protein interaction network, PPI network)，根据相互作用得分(interaction score)>0.4及剔除孤立的蛋白后整理成最后的PPI网络并进行可视化。根据PPI网络中差异蛋白之间一级邻近相互作用对计数，筛选出可能影响直肠放射性损伤的关键基因。

2 结果

2.1 癌旁正常直肠组织放疗前后差异 基因分析 从

GSE15781基因表达谱芯片中提取20例(10对)放疗前

创伤与急诊电子杂志 2019年4月 第7卷 第2期 J TRAUMA EMERG ，Apr.2019，vol.7，No.283

和放疗后的直肠癌旁正常组织基因表达谱数据用于分析放射性肠损伤相关基因(表1)，运用limma包 (截断值: |FC|>2 & P值<0.05)筛选出直肠组织放疗后对比放疗前的差异基因，其中上调基因86个，下调基因36个(表2)，R软件绘制火山图及聚类热图对差异基因进行可视化(图1)。

表1 选择GSE15781芯片组中的20例放疗前后的直肠癌旁正常组织基因表达谱数据

分组放疗前放疗后

样本编号

GSM396322, GSM396323, GSM396324, GSM396325, GSM396326, GSM396327, GSM396328, GSM396329, GSM396330, GSM396331.

GSM396341, GSM396342, GSM396343, GSM396344, GSM396345, GSM396346, GSM396347, GSM396348, GSM396349, GSM396350.

表2 利用limma包筛选出正常直肠组织放疗后对比放疗前的差异基因

放疗后v.s.放疗前

基因

OR4X2, NXF3, ADAM20, CD207, SYP, PCDH20, FLJ22761, SULT1C1, OR4F6, LOC348840, SLC30A8, SLC27A5, GPR145, CREB3L3, FLJ20105, FOXI1, SLC17A3, OPCML, LRAP, PSKH2, DBCCR1L, CDYL2, CD5L, KRTAP13-2, EXOSC6, SLICK, RUNX1, ANPEP, MGC39662, THPO, LOC375108, GPR58, ABCG4, SLC22A4, C9orf48, AIM2.

ATF3, BHLHB2, SNF1LK, NR4A1, ACCN2, DUSP1, GATM, S100B, C1orf51, CCL11, NR4A2, PDE4B, Lrp2bp, PLK2, FOSB, SLC2A3, PTGS2, EGR1, FOS, RXRG, GEM, HBEGF, C8orf4, RHOB, ETS2, MGC33530, RASD1, CGI-38, CTGF, MMP2, STOM, HAAO, PLP1, C5R1, SOCS3, LOXL1, JUNB, IFI44, CCL2, SNTB1, GNAZ, SPP1, FAM55B, SORCS1, IGFBP2, SBLF, TCEAL7, POLD1, RDH10, CYR61, FLRT1, CALD1, ELAVL4, PHLDA3, SCG3, KIAA1889, ZNF323, AKAP10, C2orf23, BOK, CALB2, RAB23, C9orf18, ARL8, SERPINE1, CYP2C9, TDO2, TNFAIP6, SNAP25, DFNA5, GDF15, TAGLN, VIP, CCL8, EGR2, FLJ10884, IL6, DKFZP434F0318, JUN, HSPB8, THBS2, CFL2, ZFHX4, DEFA6, GAL, TCF8.

上调

下调

A图1　芯片归一化和差异分析

BA. 芯片归一化之前存在非特异性结合背景噪音和测量间的非实验误差等；B. 芯片归一化以后，上述混杂因素得到消除；C. 火山图展示放疗前后直肠癌旁正常组织差异基因，红色点表示在放疗后肠组织表达上调基因，绿色点表示下调基因；D. 聚类热图显示122个放疗后对比放疗前的差异基因，红色表示上调基因，绿色点表示下调基因

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创伤与急诊电子杂志 2019年4月 第7卷 第2期 J TRAUMA EMERG ，Apr.2019，vol.7，No.22.2 差异基因功能富集分析 GO富集分析筛选出

差异基因参与了38个BP，改变直肠组织对类固醇

激素、糖皮质激素、皮质类固醇反应；组织微环境对多种免疫细胞(单核细胞、髓样细胞、白细胞)趋化和迁移；以及对各种应激反应的生物学变化(图2A)。差异基因参与的8个MF主要聚集在DNA结合转录激活因子活性、氧化还原酶活性、受体配体活性、RNA聚合酶Ⅱ激活转录因子结合、受体调节

剂活性、核受体活性、转录因子活性、直接配体调节序列特异性DNA结合等方面(图2A)。KEGG通路富集分析显示筛选出的差异基因参与介导了多条信号通路(图2B)，其中TNF信号通路(图 3A)、IL-17信号通路(图 3B)、Th17细胞分化、GnRH信号通路、Toll样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路和NOD样受体信号通路与直肠损伤存在一定相关性。

P

AP

B图2　差异基因的功能富集分析

A. 基因本体 (gene ontology, GO)富集分析显示差异基因参与的相关生物学过程(biological_process, BP)以及分子功能(molecular_

function, MF)，根据校正后P<0.05选择前10个展示；B. 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析显示差异基因可能参与调控的信号通路，根据校正后P<0.05选择前10个展示

创伤与急诊电子杂志 2019年4月 第7卷 第2期 J TRAUMA EMERG ，Apr.2019，vol.7，No.285

AB图3　差异基因参与调控与放射性肠损伤相关信号通路

A. 差异基因介导TNF信号通路；B. 差异基因参与IL-17信号通路；红色表示在放疗后肠组织表达上调基因，绿色表示下调基因

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创伤与急诊电子杂志 2019年4月 第7卷 第2期 J TRAUMA EMERG ，Apr.2019，vol.7，No.22.3 蛋白互作网络分析 将122个差异基因导入

STRING网站构建PPI网络，剔除interaction score<0.4

及孤立的节点后网络由53个节点，187个蛋白相互作用对构成 (图 4A)。根据PPI网络中差异蛋白之间

一级临近相互作用对计数，筛选出可能影响直肠放射性损伤的前20个关键基因，有IL6、FOS、JUN、CCL2、PTGS2等基因(图 4B)。

AB图4　蛋白与蛋白互相作用网络

A. 利用STRING (https://string-db.org/)数据库构建蛋白与蛋白互相作用网络，连接线粗细表示互作评分越高；B. 根据蛋白直接互相作用对数量展示前20个蛋白

3 讨论

本研究中筛选出的122个与直肠放射性损伤相关差异基因，通过GO富集分析发现放射性损伤与直肠组织对类固醇激素、糖皮质激素、皮质类固醇反应改变；组织微环境对多种免疫细胞(单核细胞、髓样细胞、白细胞)趋化和迁移；以及对各种应激反应的生物学变化密切相关。肠上皮细胞放射损伤后的死亡方式主要包括凋亡、坏死、自噬性死亡等。一些细胞和炎性因子如IL6、CCL家族蛋白等参与其中[7-9]。多种免疫细胞(单核细胞、髓样细胞、白细胞)向放射区域组织的趋化和迁移，无疑加重炎症反应促进肠损伤。减轻急性炎症反应可能有助于减轻或预防放射性肠损伤。

KEGG通路富集分析显示筛选出的差异基因参与介导了TNF信号通路、IL-17信号通路、Th17细胞分化等多条信号通路。已有多个研究[10-12]在小鼠体内证实表明TNF通路异常激活可促进炎症反应从而介导肺或脑的放射性损伤，关于此通路在肠道放射性损伤机制仍不太明确，有待更多学者进一步研究。而IL-17信号通路在急性和慢性炎症反应中起着至关重要的作用。其中IL-17A是T辅助细胞17（Th17）细胞亚群的标志性细胞因子，可参与促进自身免疫性疾病的炎症病理，而IL-17F主要参与宿主黏膜防御机制。 IL-17E（IL-25）是Th2免疫应答的放大器。IL-17C具有与IL-17A类似的生物学功能。IL-17家族通过其相应的受体发出信号并激活下游途径，包括NF-κB，MAPK和C / EBPs，以诱导细胞因子和趋化因子的表达。Xu W等[13]学者在狗体内证实了抑制IL17可减轻放射性肠炎表现。

本文通过蛋白互作网络筛选出可能影响直肠放射性损伤的前20个关键基因，其中IL6在炎症和B细胞的成熟中起作用并且具有多种生物学功能。IL6蛋白主要在急性和慢性炎症部位产生，被分泌到血

创伤与急诊电子杂志 2019年4月 第7卷 第2期 J TRAUMA EMERG ，Apr.2019，vol.7，No.287

清中并通过IL 6受体α诱导转录炎性应答，在B细胞最终分化为免疫球蛋白分泌细胞中发挥重要作用。此外，IL6基因的功能还涉及多种炎症相关疾病。CCL2是第一个被发现的趋化因子，其与受体的相互作用参与细胞的生长、发育、分化、凋亡和分布等多种生理功能，并在多种病理过程中发挥重要作用，如炎症反应、病原体感染、创伤修复及肿瘤形成和转移等。而FOS、JUN是重要的转录因子，在细胞周期调控、凋亡、细胞分化、原癌基因转化和肿瘤发生发展中起着重要作用，FOS和JUN通常还以异源二聚体转录激活蛋白-1的形式在病理过程中发挥作用，因此二者有着密切的联系[14]。目前关于FOS及JUN在放射性肠损伤中的作用机制仍不明确。

本研究不足之处在于纳入的样本量仅有20例，下一步拟在开展预实验基础上进一步扩大样本量，并延伸至体外体内验证IL6、FOS、JUN、CCL2等失调基因对肠上皮细胞的抗(促)炎症反应、增殖、凋亡及周期等生物学表型方面的影响和作用机制。分析关键失调基因与放射性肠损伤的临床指标(如：放疗中腹泻次数、持续时间、粪便常规及治疗结束后随访)相关性。

放疗过程中所致的急性或慢性肠损伤受到日益重视，本研究比较了放疗前后肠组织基因差异表达及进一步的功能分析提示放射性肠损伤是一个复杂的生物学过程，与炎症、细胞因子、免疫细胞迁移趋化、原癌基因转录因子激活等密切相关。有助于进一步认识放射性肠损伤的作用靶点和机理，为后续预测和治疗放射性肠损伤提供理论依据。

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