山东医药２０１５年第５５卷第３４期 ・论著・ 大鼠ＢＭＳＣｓ向心肌样细胞分化过程中 ｍｉＲ一１２８对Ｎｋｘ２—５基因的调控作用 朱国伟，鞠延玲，高振宇 （锦州市中心医院，辽宁锦州１２１００１） 摘要：目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）向心肌样细胞分化过程中ｍｉＲ一１２８对Ｎｋｘ２．５基因的调控作 用。方法分离培养大鼠ＢＭＳＣｓ，应用５一氮杂胞苷将其诱导为心肌样细胞，采用Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ ＰＣＲ法检测诱导６、１０、 １４、１８、２２ ｄ时ｍｉＲ一１２８、Ｎｋｘ２－５基因的表达。用生物信息学方法对ｍｉＲ一１２８和Ｎｋｘ２－５基因的靶向匹配关系进行预 测，显示ｍｉＲ一１２８与Ｎｋｘ２—５ ｍＲＮＡ的３ ＵＴＲ结合情况良好。提取心肌细胞总ＲＮＡ，扩增Ｎｋｘ２－５ ｍＲＮＡ ３ ＵＴＲ片 段，构建Ｎｋｘ２・５ ３ ＵＴＲ—ｐｍｉｒＧＬＯ荧光素酶报告载体，双荧光素酶检测转染Ｎｋｘ２—５ ３ ＵＴＲ．ｐｍｉｒＧＬＯ以及ｍｉＲ一１２８模 拟物或对照ｍｉＲＮＡ的荧光强度，鉴定ｍｉＲ １２８与Ｎｋｘ２—５的靶向关系。结果 将诱导６ ｄ的Ｎｋｘ２—５和ｍｉＲ一１２８的 表达量分别设为１，诱导１０ ｄ的Ｎｋｘ２－５表达量为４．３３－４－１．３２、２２ ｄ为１４．７８±６．０５，诱导１０ ｄ的ｍｉＲ一１２８表达量为 ０．７７６ ２±０．０５４ ３、２２ ｄ为０．１９７ ６±０．０８３ ６。ｍｉＲ・１２８与Ｎｋｘ２－５的表达呈负相关（ｒ＝一０．５４６，Ｐ＝０．０２１）。相对 于转染对照ｍｉＲＮＡ（设定其荧光素酶活性为１），转染ｍｉＲ－１２８能使Ｎｋｘ２－５ ３ ＵＴＲ—ｐｍｉｒＧＬＯ的荧光素酶表达下降为 ０．４３５ ４ ４－０．０７２ ６。结论ｍｉＲ一１２８通过结合Ｎｋｘ２—５ ｍＲＮＡ ３ ＵＴＲ抑制其表达，具有负性调控ＢＭＳＣｓ向心肌样细 胞分化过程中Ｎｋｘ２－５表达的作用。 关键词：微小核糖核酸；Ｎｋｘ２—５基因；骨髓间充质干细胞；心肌样细胞；大鼠 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１５．３４．００１ 中图分类号：Ｒ３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—２６６Ｘ（２０１５）３４—０００１－０３ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉＲ－１ ２８ Ｏｎ Ｎｋｘ２－５ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｒａｔ ＢＭＳＣｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｚＨＵ Ｇｕｏ—ｗｅｉ，ＪＵ Ｙａｈ—ｌｉｎｇ，ＧＡ０ Ｚｈｅｎ—ｖｕ （Ｊｉｎｚｈｏｕ Ｃｅｎｔｒａｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１００１，Ｃ ｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉＲ－１２８ ｏｎ Ｎｋｘ２—５ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一１２８ ａｎｄ Ｎｋｘ２—５ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ６，１０，１４，１８ ａｎｄ ２２ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｍｉＲ一１２８ ａｎｄ Ｎｋｘ２—５ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｉＲ一１２８ ｗａｓ ｗｅｌｌ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ３ 一ｌｉＢ— ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ（３ ＵＴＲ）ｏｆ Ｎｋｘ２．５ ｍＲＮＡ．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ．Ｗｅ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ Ｎｋｘ２—５ ｍＲＮＡ ３ ＵＴＲ ｓｅｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｎｋｘ２－５ ３ ＵＴＲ—ｐｍｉｒＧＬＯ ｌｕｅｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ．Ｌｕｅｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｎｋｘ２－５ ３ ＵＴＲ．ｐｍｉｒＧＬＯ．ｍｉＲ １２８ ｍｉｍｉｃｓ ｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｕａ１．１ｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｍｉＲ一１２８ ａｎｄ Ｎｋｘ２－５ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ．ＲｅｓｕｌｆｔｓⅡｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一１２８ ａｎｄ Ｎｋｘ２—５ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｄａｙ ｗａｓ ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ １．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｋｘ２－５ ｍＲＮＡ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｎｔｈ ｄａｙ ｗａｓ ４．３３±１．３２ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ １４．７８±６．０５ ｏｎ ｔｈｅ ｔｗｅｎｔｙ—ｓｅｃｏｎｄ ｄａｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一１２８ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｎｔｈ ｄａｙ ｗａｓ ０．７７６ ２±０．０５４ ３ ａｎｄ ｄｅ— ｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ ０．１９７ ６±０．０８３ ６ ｏｎ ｔｈｅ ｔｗｅｎｔｙ—ｓｅｃｏｎｄ ｄａｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一１２８ ｗａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｎｋｘ２—５ （ｒ＝一０．５４６．Ｐ＝０．０２１）． ｒｈｅ ｍｉＲ一１２８ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｋｘ２—５ ３ ＵＴＲ—ｐｍｉｒＧＬＯ ｔｏ ０．４３５ ４ ４－ ０．０７２ ６ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｆ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｄｉｉｆｎｅｄ ａｓ １）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｉＲ一１２８ ｍａｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ｎｋｘ２—５ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｎｋｘ２－５ ｍＲＮＡ ３ ＵＴＲ，ｗｈｉｃｈ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｋｘ２—５ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＢＭＳＣｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ；Ｎｋｘ２—５ ｇｅｎｅ；ｂｏｎｅ ｍａ￣ｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ；ｒａｔｓ 第一作者简介：朱国伟（１９７１・），男，副主任医师。研究方向为心脏的介入治疗。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｕｉｆｅｎｇ８００ｓｄ＠１６３．ｃｏｒｎ Ｎｋｘ２．５基因是心肌细胞发育过程中早期表达 的转录因子，于心肌细胞分化前已有表达，开始见于 心肌前体细胞并于心肌细胞分化阶段持续表达，在 胚胎和成体心肌细胞中稳定表达，是调控心肌细胞 分化的重要转录因子 。微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是 一类小的内源性非编码ＲＮＡ，广泛参与基因表达的 调控，但ｍｉＲＮＡ参与心肌样细胞的诱导分化的报道 少见。２０１４年３月，我们应用５一氮杂胞苷诱导大鼠 骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）分化为心肌样细胞，检 测分化过程中ｍｉＲ－１２８和Ｎｋｘ２．５的表达，探讨ｍｉＲ－ １２８对Ｎｋｘ２—５基因表达的调控作用。 １材料与方法 １．１ 材料４～６周龄ＳＤ大鼠，购于中国医科大学 实验动物部，体质量８０～１２０ ｇ。ＬＧ．ＤＭＥＭ培养基、 胎牛血清（ＦＢＳ）和胰蛋白酶购于Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，５．氮 杂胞苷购自Ｓｉｇｍａ公司，兔抗大鼠多克隆ｃＴｎＩ和 Ｎｋｘ２．５抗体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司，小鼠胚胎成纤维 细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞系购于中国医学科学院基础医学 研究所。 １．２心肌样细胞的诱导将大鼠脱颈处死，取出股 骨和胫骨，反复冲出骨髓，接种到２５ ｃｍ 培养瓶内； 于３７ ｏＣ、５％ＣＯ 培养箱中培养，每３～４ ｄ换液１ 次，待细胞达到８０％融合后，用０．２５％胰酶消化，收 集细胞传代。取第３代细胞做诱导，培养基中加入 １０￣ｍｏＬ／Ｌ的５一氮杂胞苷培养２４ ｈ后，更换完全培 养基培养３周；倒置显微镜下观察，显示ＢＭＳＣｓ均 匀分布，呈梭形，诱导后细胞变细长，形态规则，平行 排列。采用免疫荧光法检测ｃＴｎＩ和Ｎｋｘ２．５蛋白的 表达，光镜下显示细胞内ｃＴｎＩ呈绿色荧光，Ｎｋｘ２．５ 蛋白呈红色荧光，二者均呈高表达。提示ＢＭＳＣｓ向 心肌样细胞转化。 １．３ ｍｉＲ一１２８、Ｎｋｘ２．５表达检测 采用Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法。取诱导６、１０、１４、１８、２２ ｄ的细胞，分别 加入ＲＮＡｉｓｏ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ＴａＫａＲａ）和ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ 提取总ｍｉＲＮＡ和总ＲＮＡ；用ＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅ水稀释为１ Ｌ，按照ＴａＫａＲａ反转录试剂盒说明进行反转 录；得到的ｃＤＮＡ样品稀释４倍，加入ＳＹＢＲ＠Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ删ｌＩ（ＴａＫａＲａ）和ｍｉＲ．１２２检测引物或Ｎｋｘ２— ５检测引物；以ｕ６或ＧＡＰＤＨ为内参基因，在实时 定量ＰＣＲ仪上进行４０个循环的ＰＣＲ反应，应用软 件对反应结果进行定量分析。 １．４ ｍｉＲ－１２８与Ｎｋｘ２—５的靶向关系预测采用靶 基因预测软件ｍｉＲａｎｄａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／） 和ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｅａｎ．ｏｒｇ／）对ｍｉＲ一 １２８和Ｎｋｘ２—５基因（ＮＭ一０５３６５１）的靶向匹配关系 ２ 山东医药２０１５年第５５卷第３４期 进行预测，结果表明ｍｉＲ一１２８与Ｎｋｘ２—５ ｍＲＮＡ的３ ＵＴＲ结合情况良好。 １．５ ｍｉＲ一１２８与Ｎｋｘ２—５的靶向关系鉴定 １．５．１ Ｎｋｘ２—５ ３ ＵＴＲ的克隆取诱导培养２２ ｄ的 心肌样细胞，加入ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ提取总ＲＮＡ；反转录 为ｃＤＮＡ，利用正向引物５ 一ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧ— ＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡ一３ 和反向引物５，＿ＧＣＴＣＴＡＧＡＧ— ＧＴｃｃＴＧ ＩＴｒＧＧＧＴＣＣＧＴ一３ 扩增Ｎｋｘ２—５ ｍＲＮＡ ３ ＵＴＲ 片段；琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，克隆到ｐＭＤ １８．Ｔ（ＴａＫａＲａ）载体上测序。 １．５．２ Ｎｋｘ２—５ ３ ＵＴＲ—ｐｍｉｒＧＬＯ的构建分别用 Ｓａｃ Ｉ和Ｘｂａ Ｉ双酶切ｐｍｉｒＧＬＯ质粒载体以及Ｎｋｘ２． ５ ３ ＵＴＲ，参照ＴａＫａＲａ ＤＮＡ连接试剂盒说明书，将 Ｎｋｘ２—５ ３ ＵＴＲ酶切片段与ｐｍｉｒＧＬＯ载体酶切片段 相连；构建Ｎｋｘ２－５ ３ ＵＴＲ．ｐｍｉｒＧＬＯ荧光素酶报告载 体，转化入ＤＨ５ｃ￣感受态细胞中克隆扩增；按照 ＡｘｙＰｒｅｐ质粒ＤＮＡ小量试剂盒（Ａｘｙｇｅｎ）说明书从 菌液中提取重组质粒，测序鉴定。 １．５．３双荧光素酶检测取ＮＩＨ３Ｔ３细胞，加入含 １０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中。转染前１ ｄ，胰酶消 化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日融合为 ９０％～９５％。对于每孔细胞，利用Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）转染Ｎｋｘ２．５ ３ ＵＴＲ—ｐｍｉｒＧＬＯ ２００ ｎｇ以及ｍｉＲ一１２８模拟物或对照ｍｉＲＮＡ ３０ ｎｍｏ￣Ｌ； 转染２４ ｈ后，按照Ｐｒｏｍｅｇａ公司Ｄｕａｌ—Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ￣￣ 告基因检测系统检测两组荧光强度。 １．６统计学方法应用ＳＰＳＳ１３．０统计软件。结果 以 ±ｓ表示，比较采用ｔ检验；相关性分析采用 Ｐｅａｒｓｏｎ直线相关。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１ ｍｉＲ一１２８、Ｎｋｘ２－５表达将诱导６ ｄ的Ｎｋｘ２—５ 和ｍｉＲ一１２８的表达量分别设为１，诱导１０ ｄ的Ｎｋｘ２— ５表达量为４．３３ ４－１．３２、２２ ｄ为１４．７８ ４－６．０５，诱导 １０ ｄ的ｍｉＲ．１２８表达量为０．７７６ ２ ４－０．０５４ ３、２２ ｄ 为０．１９７ ６±０．０８３ ６。相关性分析显示，二者呈负 相关（ｒ＝一０．５４６，Ｐ＝０．０２１）。 ２．２ ｍｉＲ一１２８对Ｎｋｘ２—５表达的调控作用 双荧光 素酶检测结果显示，相对于对照ｍｉＲＮＡ（设定其荧 光素酶活性为１），ｍｉＲ．１２８能使Ｎｋｘ２－５ ３ ＵＴＲ． ｐｍｉｒＧＬＯ的荧光素酶表达下降为０．４３５ ４ ４－ ０．０７２ ６。 ３讨论 ＮＫ－２基因主要编码转录激活因子，能够结合目 的基因启动子的共有序列［Ｔ（Ｃ／Ｔ）ＡＡＧＴＧ］，从而 激活转录。Ｎｋｘ２—５基因是ＮＫ型同源盒基因家族成 山东医药２０１５年第５５卷第３４期 员之一，其蛋白产物为心肌前体细胞早期标志物，在 心肌细胞分化前就已经表达，于分化过程中高表达， 是心肌细胞分化过程中的重要转录因子 Ｊ。 Ｌｙｏｎｓ等 研究发现，敲除Ｎｋｘ２ ５基因的小鼠心脏 发育出现异常。Ｓｃｈｏｔｔ等 发现，先天性心脏病患 者中Ｎｋｘ２—５基因发生突变，其类型主要是无义突 变、ＲＮＡ剪接信号突变以及阅读框架异位突变等。 虽然发育阶段的脾、胃和甲状腺组织有少量Ｎｋｘ２－５ 蛋白表达，但出生后其表达水平显著降低，而心肌中 有显著的特异性表达。表明Ｎｋｘ２．５蛋白对多种器 官发育有影响，但主要以对心肌的发育和分化作用 为主 Ｊ。本研究应用５一氮杂胞苷将大鼠ＢＭＳＣｓ诱 导为心肌样细胞，免疫荧光化学检测发现诱导后细 胞内有ｃＴｎＩ和Ｎｋｘ２－５蛋白表达。 ｍｉＲＮＡ广泛参与生命活动过程中的基因表达 调控¨ ” ，其中ｍｉＲ一１２８参与了细胞分化以及癌症 发生等过程中基因表达的调控。Ｓｈｉ等 研究发 现，ｍｉＲ－１２８能够靶向作用于成肌细胞分化过程中 的重要转录因子肌生成抑制蛋白，过表达ｍｉＲ一１２８ 能够抑制小鼠成肌细胞系Ｃ２Ｃ１２的增殖，却促进其 分化为肌细胞。Ｈｕａｎｇ等 应用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检 测肝细胞癌组织中ｍｉＲ一１２８的表达，发现其较癌旁 正常组织显著降低，进一步在肝癌细胞系中发现 ｍｉＲ－１２８能够靶向调控ＰＩ３ＫＲ１的表达，激活ＰＩ３Ｋ／ ＡＫＴ信号转导通路，抑制癌细胞的增殖，推测其或 可作为诊断肝细胞癌的标志物。 本次研究运用靶基因预测软件ｍｉＲａｎｄａ和 ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ对ｍｉＲ．１２８和Ｎｋｘ２．５基因的靶向匹配关 系进行预测，发现二者匹配关系良好。随后通过双 荧光素酶报告系统研究发现，ｍｉＲ一１２８能够靶向作 用于Ｎｋｘ２．５ ３ ＵＴＲ并抑制其表达。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ 结果表明随着诱导时间延长，ｍｉＲ．１２８表达量逐渐 降低，与Ｎｋｘ２．５表达量呈负相关，提示ｍｉＲ．１２８参 与了心肌样细胞的诱导分化过程。 参考文献： ［１］Ｉｎｇａ Ａ，Ｒｅａｍｏｎ—Ｂｕｅｔｔｎｅｒ ＳＭ，Ｂｏｒｌａｋ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃ— ｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＮＫＸ２－５ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｙｅａｓｔ—ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ ３．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２００５，１４（１４）：１９６５－１９７５． ［２］Ｄｏｒｎ Ｔ，Ｇｏｅｄｅｌ Ａ，Ｌａｍ ＪＴ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｒｅｃｔ ｎｋｘ２－５ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｓｕｂｔｙｐｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ［Ｊ］．Ｓｔｅｉｎ Ｃｅｌｌｓ，２０１５，３３（４）：１１１３—１１２９． ［３］Ｄｅｎ Ｈａｒｔｏｇｈ ＳＣ，Ｓｃｈｒｅｕｒｓ Ｃ，Ｍｏｎｓｈｏｕｗｅｒ—Ｋｌｏｏｔｓ ＪＪ，ｅｔ ａ１．Ｄｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＭＥＳＰＩ ｍＣｈｅｒｒｙ／ｗ—ＮＫＸ２－５ ｅＧＦＰ／ｗ ｈＥＳＣｓ ｅｎａｂｌｅ ｓｔｕｄ— ｙｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１５，３３ （１）：５６－６７． ’ ［４］Ｗｕ Ｍ，Ｐｅｎｇ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｂａｆ２５０ａ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ ａｎ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｒｅｐｒｅｓｓ ｔｈｅ Ｎｋｘ２．５－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏｄｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１４，２４（１０）：１２０１— １２１３． ［５］Ｃａｒｔｅｒ ＤＲ，Ｂｕｃｋｌｅ ＡＤ，Ｔａｎａｋａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａｒｔ２７ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＧＡ— ＴＡ４，ＦＯＧ２ ａｎｄ ＮＫＸ２．５ ａｎｄ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏ—ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（４）：９５２５３． ［６］Ｂｅｈｒｅｎｓ ＡＮ，Ｉａｃｏｖｉｎｏ Ｍ，Ｌｏｈｒ儿，ｅｔ ａ１．Ｎｋｘ２—５ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒ－ ｅｎｔｉａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈｏｘａｌ０［Ｊ］． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ，２０１３，２２（１５）：２２１１－２２２０． ［７］Ｌｙｏｎｓ Ｉ，Ｐａｒｓｏｎｓ ＬＭ，Ｈａｒｔｌｅｙ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｍｙｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅ— ｎｅｔｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｔｕｂｅｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂ￣ｏｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｈｏ— ｌｎｅｏ ｂｏｘ ｇｅｎｅ Ｎｋｘ２－５［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１９９５，９（１３）：１６５４—１６６６． ［８］Ｓｃｈｏｔｔ ＪＪ，Ｂｅｎｓｏｎ ＤＷ，Ｂａｓｓｏｎ ＣＴ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＮＫＸ２－５［Ｊ］．Ｓｃｉ－ ｅｎｅｅ，１９９８，２８１（５３７３）：１０８—１１１． ［９］Ｓｔｅｎｎａｒｄ ＦＡ，Ｃｏｓｔａ ＭＷ，Ｅｌｌｉｏｔｔ ＤＡ，ｅｔ ａ１．Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｂｏｘ ｆａｃｔｏｒ Ｔｂｘ２０ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｎｋｘ２－５，ＧＡＴＡ－４，ａｎｄ ＧＡＴＡ５ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｈｅａｒｔ［Ｊ］．Ｄｅｖ Ｂｉ— ｏｌ，２００３，２６２（２）：２０６－２２４． ［１Ｏ］Ｊａｙａｗａｒｄｅｎａ Ｔ，Ｍｉｒｏｔｓｏｕ Ｍ，Ｄｚａｕ ＶＪ．Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈ— ｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１４，１１５０：２６３－２７２． ［１ １］Ｋｕｍａｒｓｗａｍｙ Ｒ，Ｖｏｌｋｍａｎｎ Ｉ，Ｊａｚｂｕｔｙｔｅ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ—Ｂ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ—ｔｏ—ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｓ ｐａｒｔｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２０１２，３２（２）：３６１—３６９． ［１２］Ｍｕｒａｏｋａ Ｎ，Ｙａｍａｋａｗａ Ｈ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａ１．ＭｉＲ一１３３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｓｎａｉｌ ａｎｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｆｉ－ ｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯ Ｊ，２０１４，３３（１４）：１５６５—１５８１． ［１３］Ｊａｙａｗａｒｄｅｎａ ＴＭ，Ｅｇｅｍｎａｚａｒｏｖ Ｂ，Ｆｉｎｃｈ ＥＡ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ— ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏ－ ｂｌａｓｔｓｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２０１２，ｌ１０（１１）：１４６５・ １４７３． ［１４］Ｓｈｉ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｂ，Ｌｉ Ｐ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ一１２８ ｔａｒｇｅｔｓ ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ａｔ ｃｏｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，２０１５，２７（９）：１８９５—１９０４． ［１５］Ｈｕａｎｇ ＣＹ，Ｈｕａｎｇ ＸＰ，Ｚｈｕ ＪＹ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ一１２８－３ｐ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＰＩ３ＫＲ１ ａｎｄ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＣＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ， ２０１５，３３（６）：２８８９－２８９８． （收稿日期：２０１５－０５—１１） ３
