将大鼠海马神经元细胞终浓度(2*106个/ml)接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中,每孔2.5ml,培养条件同上,培养至第8天,用免疫组化法鉴定。
步骤如下:
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍,冷丙酮固定10min。
2.PBS冲洗3遍,3%H2O2(30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合)封闭内源性过氧化物酶,室温下10min。
3.PBS冲洗3遍,0.3%Triton破膜(溶解细胞膜,细胞核膜细胞器膜上的脂质)15min,PBS洗3遍。
4.10%羊血清封闭,室温10min,吸弃上清(不洗)。
一抗37℃反应1h(20μL的NSE+1ml稀释液),设空白对照,以PBS代替一抗 5.PBS洗3*5min,二抗(羊抗兔)室温下18min,PBS洗3*5min,SABC复合物37℃,18min。
(二抗标记的FITC在紫外光激发下显色)
6.PBS洗3*5min,DBA显色(5min)。镜下观察,自来水终止。
DBA稀释度(1:50),苏木素复染(3min),95%乙醇脱水,二甲苯透明20min,中性树胶封固,风干,镜下观察。
注:PBS用0.01M的(配置成0.1M的,用时稀释)。
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