NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用

文章编号:1007-8738(2003)04-357-04

NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用

吴国强1,3,刘新平2,王立峰2,张文红2,张　健2,李开宗1,窦科峰1,张雪峰3,药立波2(第四军医大学1西京医院

肝胆外科,2基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032;3沈阳军区总医院普通外科,辽宁沈阳110015)

InductionofapoptosisofHepG2cellsbyNDRG2

WUGuo2qiang

1,3

,LIUXin2pin2,WANGLi2feng2

,

ZHANGWen2hong2

,ZHANGJian2

,LIKai2zong1

,DOUKe2feng1,ZHANGXue2feng3

,YAOLi2bo

2

1DepartmentofHepato2biliarySurgery,XijingHospital,

2

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,FourthMil2

itaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China

Abstract

AIM:ToexploretheinductionofHepG2cellsbyNDRG2gene.METHODS:HumanNDRG2genewasobtainedbyRT2PCR.SequenceanalysisprovedthatsequenceofNDRG2genewascorrect.Thenthegenewasinsertedintotheeukoryoticexpres2sionvectorpIRES22EGFPandtransfectedintoNDRG2gene2negativeHepG2cells.Thechangesofcellmorphologyandstructurewereobservedunderlight,fluorescenceandtransmis2sionelectronmicroscope,respectively.Thevariationofcellcy2clewasdetectedbyFlowcytometry.RESULTS:TheNDRG2genehadbeenobtainedanditsexpressionvectorwascon2structedsuccessfully.TheNDRG2gene2transfectedHepG2cellswerecharacterizedbyabadcondition,structuredamage,andagreatnumberofdiedcells.Theexpressionoftargetgeneincy2toplasmofHepG2cellswasseenunderfluorescencemicro2scope.FlowcytometryanalysisshowedG1phasearrestandapoptosispeakappeared.Thetypicalmanifestationofcellapoptosiscouldbeobservedundertransmissionelectronmicro2scope.CONCLUSION:NDRG2genecanarrestHepG2cellproliferationandinducestheirapoptosis.Keywords:NDRG2;HepG2;GFP;apoptosis

摘要

目的:探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用。方法:用RT2PCR获取NDRG2基因。测序判断正确后,将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体

pIRES22EGFP中,并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞。收稿日期:2002-09-03;　修回日期:2002-11-21基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.39870718)

国家杰出青年科学基金资助(No.39825113)

作者简介:吴国强(19682),男,四川成都人,博士生.

通讯作者:药立波.Email:bioyao@mail.fmmu.edu.cn

用光镜观察转染细胞的形态变化;荧光显微镜观察NDRG2蛋白的定位;流式细胞仪分析细胞周期的改变;透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。结果:获得了NDRG2基因,成功地构建了pIRES22EGFP2NDRG2真核表达载体。转染

HepG2细胞后,细胞生长受抑,结构破坏并死亡。荧光显微

镜观察到NDRG2在胞质中表达,流式细胞仪检测出现G1期阻滞和凋亡峰,透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论:

NDRG2基因具有诱导HepG2细胞凋亡的作用,其机制有待进一

步研究。

关键词:NDRG2;HepG2;GFP;细胞凋亡中图分类号:Q556+.9　　　文献标识码:A

　　随着现代分子生物学和基因工程技术飞速发展,人类基因组计划的完成,肝癌的基因治疗显示了良好的应用前景,因此,积极探索肝癌相关基因及抑癌基因已成为新的热点。人NDRG2基因是本校生物化学与分子生物学教研室于1999年采用锚定引物从正常人脑组织克隆到的一个新基因[1](名称:SyldGenBank登录号:AF159092),属于NDR(N2myc

downstreamregulatedgene)家族中的2型基因,染色体上定位

于14q11.2,含有16个外显子,15个内含子,mRNA全长为

2024nt,编码357个氨基酸残基,其Mr为40000。初步研

究显示,NDRG2基因为正常脑、胶质瘤组织和肺、肺癌组织的差异表达基因[2],因此,我们推测其可能为一种新的抑癌基因。本实验旨在探索NDRG2基因转染对肝癌细胞HepG2的影响,进一步明确其功能。

1　材料和方法

1.1　材料　人肝癌细胞系HHCC、SMMC7721、HepG2、永

生化肝细胞系QZG及感受态细胞DH5

α,均由基础部生化实验室保存。新生牛血清购于北京四季青生物技术公司。TRIzol

Reagent购于GibcoBRL公司。DNasel及DEPC购于Sigma公司。

逆转录试剂盒购于Promega公司。羊抗鼠IgG购于Gibco公司。增强型化学发光系统购于Pierce公司。PCR产物胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒为上海华舜公司产品。T4DNA连接酶、

BamHI、EcoRI、BglⅡ及NheⅠ,均为Takara公司产品。抗NDRG2单抗(mAb)由本校免疫学教研室协助制备。

1.2　方法

1.2.1　肝癌细胞系的筛选　肝癌细胞HHCC、SMMC7721、HepG2及永生化QZG,用含100mL/L小牛血清DMEM(含

青霉素1×105U/L及链霉素100mg/L)于37℃、50mL/L

CO2条件下培养。待80%铺满瓶时,各取两瓶,弃培养液,

用2.5g/L胰酶消化,1×PBS离心洗涤2次,分别进行RT2

358ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2003,19(4)PCR及Westernblot检测。①RT2PCR:于所收每瓶细胞中,加入1mLTRIzol提取液,用1mL注射器反复抽吸,其余步骤严格按TRIzolReagent说明书进行。所得RNA经DNaseⅠ消化后,溶解于DEPC处理水中,用Promega公司的逆转录试剂盒合成cDNA,以G3PDH基因表达为内参照进行半定量

RT2PCR。扩增NDRG2基因及G3PDH基因的引物由北京赛

百盛公司合成。扩增NDRG2基因的正反向引物序列分别为5′2GCGGATCCATGGCGGAGCTGCAGGAGGTG

23′;5′2GC2GAATTCAACAAGGGCCATTCAACAGGAGAC23′。将正反向

引物分别移入BamHI、EcoRI酶切位点,产物片段为1170

bp。G3PDH正向引物的序列为:5′2GCCTCAAGAT2CATCAGCAAT23′;反向引物为:5′2AGGTCCACCACTGA2CACGTT23′,产物片段为307bp。扩增NDRG2基因的循环参

数为:94℃30s,94℃5s,72℃4min(5个循环);94℃5s,

70℃4min(5个循环);94℃5s,68℃4min(25个循环);再

72℃7min。扩增基因的G3PDH循环参数:94℃30s,52℃30s,72℃1min(35个循环);再72℃7min。取20μLPCR

反应液,在8g/L琼脂糖凝胶中电泳分离,以EB染色后照相。②Westernblot检测:每瓶细胞加入预冷的蛋白裂解液1

mL,用1mL注射器反复抽吸,于4℃以12000r/min离心。

取上清,按Bradford法进行蛋白定量。将提取的总蛋白进行

SDS2PAGE分离,再转移至NC膜上,以丽春红染色后,洗

膜、封闭,加入抗NDRG2mAb(1∶500)4℃过夜。洗膜后,加入羊抗鼠IgG(1∶3000)37℃1h。洗膜后压干,于暗室中在ECL反应液中反应2min,压X光片2～20min,显影及定影。

1.2.2　PCR产物鉴定　回收琼脂糖凝胶中的PCR产物,与

载体pMD182T连接,转化DH5

α感受态细胞。铺板,经蓝白和氨苄双筛选,挑取白色菌落扩大培养,提取质粒DNA,以

BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切鉴定,并进行序列测定。

1.2.3　真核表达载体pIRES22EGFP2NDRG2的构建　用BamHI及EcoRI双酶切载体pMD182T,在8g/L琼脂糖凝

胶中电泳分离。回收琼脂糖凝胶中的PCR产物,用BglⅡ及

EcoRI双酶切载体pIRES22EGFP,连接后,转化DH5α感受态细胞。铺板,经卡那霉素筛选,挑取白色菌落扩大培养,提取质粒DNA,以NheⅠ及EcoRⅠ双酶切鉴定。

1.2.4　NDRG2对HepG2细胞生长的影响　将处于对数生

长期的HepG2细胞,用2.5g/L胰酶消化后,以一定密度接种于6孔板中。试验组和对照组各3孔,每组各有1孔预先置入酸处理过的盖玻片中。待80%铺满后,吸出培养液,按

LipofectAMINE说明书的方法进行转染,每孔加入pIRES22EGFP2NDRG2或pIRES22EGFP4μg及脂质体5μL。先将质

粒及脂质体各加入无血清DMEM250μLl中5min,再将两者混合,轻轻摇动后,室温放置20min。待其形成DNA2lipo2

some复合物后,加入孔中,再加入无血清DMEM使每孔培养

液体积达2mL。于37℃50mL/LCO2条件下培养6h。吸弃转染液,加入2mL含100mL/L小牛血清DMEM培养液,于上述条件下继续培养。①形态学观察:转染72h后,取出盖玻片,用1×PBS洗两遍,加950mL/L乙醇固定20min,再以1×PBS洗两遍,进行HE染色后,光镜下观察。②荧光

显微镜观察:转染72h后,取出盖玻片,以1×PBS洗两遍,加多聚甲醛固定20min,再以1×PBS洗两遍,将盖玻片反扣在滴有甘油的载玻片上,观察。③流式细胞仪检测:转染72h后,加入2.5g/L胰酶消化成单细胞,离心收集,以1×PBS洗两遍,先加入1mL1×PBS,再加入2mL无水乙醇,立即振荡混匀,随即送检。④转染72h后,按③收集细胞(>5×

106),弃上清,向细胞团块中轻轻滴加固定液,送交电镜室切片、

染色及观察。

2　结果

2.1　3种肝癌细胞及永生化肝细胞系NDRG2的表达　采用RT2PCR方法,在RNA水平上检测3种肝癌细胞及永生化肝

细胞系NDRG2基因的表达。HHCC、SMMC7721及QZG细胞中均扩增出1.2kb的片断;而HepG2细胞中未见表达(图

1A)。图1B显示模板正确。NDRG2的Mr约为40000。在

蛋白水平上,用Westernblot分析的结果与RT2PCR的结果一致,在HpG2细胞中未见NDRG2蛋白的表达(图2)。

图1　NDRG2和G3PDH表达的RT2PCR检测

Fig1　DetectionoftheexpressionsofNDRG2andG3PDHby

RT2PCR

A:ExpressionofNDRG2;B:ExpressionofG3PDH.1:HHCCcells;2:SMMC7721cells;3:HepG2cells;4:QZGcells;5:PCRmarker.

图2　NDRG2蛋白的Westernblot检测

Fig2　DetectionoftheNDRG2proteinbyWesternblot

1:QZGcells;2:HepG2cells;3:SMMC7721cells;4:HHCCcells.

2.2　PCR产物及pIRES22EGFP2NDRG2的鉴定　用BamHI

及EcoRI双酶切载体pMD182T,经8g/L琼脂糖凝胶电泳后,出现1.2kb的条带(图3),大小同预期的结果。经序列测定,blast分析,其插段序列与GenBank中已登录的NDRG2基因的序列完全符合。构建的pIRES22EGFP2NDRG2载体中,原5′BamHI酶切位点消失,故采取NheⅠ(在BglⅡ的上游存在NheⅠ的酶切位点)与EcoRI双酶切,经8g/L琼脂糖凝胶电泳出现约1.2kb大小的条带(图4),同预期结果相符,说明目的基因片段已成功地克隆入载体中。

2.3　NDRG2基因对HepG2细胞生长的影响　将pIRES22EGFP与pIRES22EGFP2NDRG2分别转染HepG2后72h,光

镜下观察,pIRES22EGFP转染的细胞生长良好;而pIRES22

EGFP2NDRG2转染的细胞状态很差,细胞边缘模糊,部分细

胞已死亡(图5)。荧光显微镜观察,NDRG2蛋白定位于胞浆中(图6)。流式细胞仪检测pIRES22EGFP转染的细胞G1期为

ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2003,19(4)55.09%;pIRES22EGFP2NDRG2转染的细胞G1期为68.5%,

359

可见转染pIRES22EGFP2NDRG2的细胞出现细胞凋亡的特征:核浓缩、染色体边集及凋亡小体形成(图8)。

并出现凋亡峰(调亡率14.3%)(图7)。进一步透射电镜观察,

图3　质粒PMD182T2NDRG2的酶切鉴定

Fig3　EnzymedigestionanalysisofpMD182T2NDRG2

1:PCRmarker;2:pMD182T2NDRG2;3:pMD182T2NDRG2/BamHI+EcoRI.

图4　质粒pIRES22EGFP2NDRG2的酶切鉴定

Fig4EnzymedigestionanalysisofplasmidpIRES22EGFP2NDRG2

1:PCRmarker;2:pIRES22EGFP2NDRG2;3:pIRES22EGFP2

NDRG2/NheⅠ+EcoRI.

图5　转染HepG2细胞的光镜观察

Fig5　ThemorphologicalobservationoftransfectedHepG2cellsunderlightmicroscopy(×200)

A:TransfectedwithpIRES22EGFP;B:TransfectedwithpIRES22EGFP2NDRG2;C:NormalHepG2cells.

图6　目的基因转染后HepG2细胞的荧光显微镜观察

Fig6　ObservationofHepG2cellstransfectedwithtargetgene

underfluorescencemicroscope(×200)

图7　细胞周期改变的流式细胞仪检测Fig7　DetectionofthecellcyclechangesbyFCM

A:TransfectedwithpIRES22EGFP;B:TransfectedwithpIRES22EGFP2NDRG2.

图8　目的基因转染后细胞形态的电镜观察

Fig8　ElectronmicroscopephotographsofHepG2cellstransfectedwithtargetgene(×6000)

A:Nucleusclumping;B:Apoptoticbodyformation;C:NormalHepG2cell.

360ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2003,19(4)3　讨论

已发现人NDRG家族中有4个成员:NDRG1、NDRG2、

NDRG3和NDRG4。其中NDRG4包括3个异构体:NDRG42B、NDRG42B

(var)

及NDRG42H。NDRG1主要表达于肝及肠上

皮细胞,NDRG2主要分布于心和中枢神经系统,NDRG3在脊髓和胸腺始基表达最多[3],NDRG4主要位于心脏和肝组织[4]。目前,关于NDR基因家族功能的研究主要来自

NDRG1,而其他成员尚未见有关表达调节及功能的研究报

道。研究表明,NDRG1有抑制细胞增殖、调节细胞周期[5]及抑制肿瘤发生[6]的作用,并参与缺氧[7]、ER应激反应[8]等.

邓艳春,李剑等[1,2]曾用MTE杂交膜进行打点杂交表明,NDRG2基因在人中枢神经系统的大脑皮质、白质和神经核中呈广泛高表达,在与神经细胞同样属于终末分化细胞的唾液腺细胞和骨骼肌细胞中也呈高表达;而在具有分裂能力的骨骼肌干细胞和精细胞中表达量很低;在分裂增埴能力旺盛的10种肿瘤细胞(包括白血病、淋巴瘤、肺癌、结肠癌、胶质瘤和腮腺瘤)中无表达。在胚胎的脑、心、肝、肾、肺等脏器的表达量低于成人相应器官,而且,其表达量与器官的成熟程度呈正相关。另外,用RT2PCR技术,在mRNA水平上检测了多种组织中NDRG2基因的表达水平,结果发现,人脑与胶质瘤、肺与肺癌、结肠与结肠癌中均有NDRG2水平的表达,其表达水平以脑组织为最高,并且在脑和肺组织的表达水平显著高于胶质瘤与肺癌,表明NDRG2为正常脑组织与胶质瘤、肺与肺癌差异表达的基因[2]。为了进一步研究NDRG2基因的功能,我们首先采用RT2PCR和Westernblot方法筛选出NDRG2表达阴性HepG2细胞,然后从RNA和蛋白水平两方面相互验证,使结果更为可靠。并且构建了pIRES22

EGFP2NDRG2表达载体,通过荧光显微镜观察GFP的存在,

可间接说明目的基因的表达。试验结果表明,转染pIRES22

EGFP的对照组细胞生长良好;而转染目的基因的试验组细

胞则变得稀少,生长状态差。同时,荧光集中于细胞质,说明

NDRG2蛋白属于胞浆蛋白,与李剑等

[2]

的报道相一致。流

式细胞仪检测发现,试验组细胞出现G1期阻滞和凋亡峰,透射电镜观察见染色体边集、出泡、凋亡小体形成及胞体裂解等细胞凋亡的典型特征。上述结果表明,NDRG2具有诱导

HepG2细胞调亡的作用。

目前,关于NDRG2蛋白的结构和作用机制还不明确。我们曾对NDRG2蛋白的二级结构和折叠进行了生物信息学分析(3D2PSSM:http://www.bmm.icnet.uk/～3dpssm/,UC2

SC:http://www.cse.ucsc.edu/research/compbio/HMM2apps,PSA:http://bmerc2www.bu.edu/psa,Superfamily:http://sup2fam.net/SUPERFAMILY/index.html)。结果发现,NDRG2

蛋白在二级结构上,属于α/β水解酶家族。α/β水解酶家族包括多种细胞抗氧化应激酶类,NDRG2蛋白与其中的细菌环氧化物水解酶极为相似,推测NDRG2蛋白的功能包括:参与细胞抗氧化应激反应,维持细胞内氧还电势平衡,参与内外源有毒物质的代谢以及间接影响细胞的生长分化和癌变等。

总之,本实验初步揭示了NDRG2基因的功能,为进一步研究该基因在肿瘤发生、发展中的作用,以及其在肿瘤基因治疗中的地位奠定了基础。

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