维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年第３５卷第１期Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ！ ｏ７ ０ｌ：箜— ７３ 微载体培养动物细胞技术的研究进展 过琴媛，王辉综述；沈心亮审校 （北京天坛生物制品股份有限公司，北京 １ｏ００２４） 摘要：微载体是一种新兴的大规模细胞培养技术，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。它具有均相 培养兼具平板培养和悬浮培养的优势，培养条件（温度、ｐＨ值、二氧化碳浓度等）容易控制，并且培养过程系统化、 自动化，不易被污染。本文简要介绍了近几年来常用的几种制备微载体的天然聚合材料，比较了固体微载体和液 体微载体各自特点，列举了微载体培养技术的几种生物反应器系统。 关键词：微载体；细胞培养 中图分类号：ＱＳ１３‘１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５－５６７３（２００７）０１－００７３－０３ １９６７年Ｖａｎ Ｗｅｚｅｌ为贴壁依赖性细胞的高产培 物相容性好，价格相对低廉。明胶中的角蛋白、弹性 养提出了“微载体”培养系统的新技术概念。经过 硬蛋白、黑素和软骨素等的存在是促进细胞粘附生 几十年的研究改进，微载体培养技术现已广泛地应 长的一个重要因素。许多由其它基质制成的微载 用于动物细胞的培养。 体 如Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、ＣＴ－３等，也常包裹一层明胶以提高 １微载体培养动物细胞的特点 载体的生物相容性。已经商品化的明胶微载体有 微载体是指直径在６Ｏ一２５０￣ｍ，适用于贴壁依 Ｇｅｌｉｂｅａｄ（Ｈａｚｅｌｍｎ实验室研制）、Ｖｅｎｔｒｅｇｅｌ（Ｖｅｎｔｒｅｘ 赖型细胞在其表面贴壁生长的微珠。微载体能成为 实验室研制）及大孔的Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ微载体（Ｈｙｃｌｏｎｅ 迄今常用而有效的动物细胞培养载体，除了由于许 生产）。 多病毒疫苗和重组蛋白依赖贴壁细胞系生产的限制 ２．２胶原 外，还因微载体具有以下的优点：①兼具单层培养和 胶原是一类可用于引导组织再生的生物材料， 悬浮培养的优势，且是均相培养；②细胞所处环境均 无抗原性，生物相容性好，可参与组织愈合过程。许 一；③环境条件（温度、ｐＨ、ＣＯ 等）容易测量与监控； 多研究表明，变性胶原多肽一级结构的某些特定位 ④具有较高的比表面；⑤培养操作可系统化、自动 点可与培养液中纤粘素结合，形成胶原一纤粘素的 化，降低了污染发生的机会。 复合物，有助于细胞的粘附与生长，这也是胶原在制 ２ 制备微载体的材料 备微载体方面倍受青睐的原因。在动物细胞培养中 制备微载体的材料按其来源可分为两大类：人 得到广泛应用的Ｃｙｔｏｄｅｘ３（ＰｈａｒｍａｃｉａＣｏ．）和多孔 工合成聚合物和天然聚合物及其衍生物。早期微载 Ｍｉｃｍｓｐｈｅｒｅ（Ｖｅｒａｘ）就是以胶原为基材制备的。也 体多采用人工合成聚合物如聚甲基丙烯酸＿２羟乙 有将胶原用于微载体表面包覆材料的报道，如Ｈｉｌｌ— 酯（ＰＨＥＭＡ）、聚苯乙烯（ｅｓ）、聚丙烯酰胺、聚氨酯 ｅｇａｓ¨ 等在聚苯乙烯微球表面包覆一层胶原后表 泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等制备。近年来， 现出很好的效果。 越来越多的研究者尝试用天然聚合物及其衍生物来 ２．３纤维素 制备微载体。天然聚合物来源丰富，在功能适应性、 纤维素是由以１，４一葡萄糖苷键连接的、ｐ—Ｄ一吡 组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优 喃葡萄糖元组成的一种均聚多糖。商品化的纤维素 于人工合成材料。在用于制备微载体的天然聚合物 微载体，如有大孔的ＣｅＨｓｎｏｗ（Ｋｉｒｉｎ Ｌｔｄ．）和Ｃｙｔｏ— 中，研究较多的有以下几种： ｐｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏ．）等。其优点是机械强度高，可 ２．１ 明胶 回收使用。 明胶是胶原蛋白经温和、不可逆降解的产物，生 ２．４甲壳质及其衍生物 收稿日期：２００６－０５－２３；修回日期：２００６－０８－１４ 甲壳质及其衍生物壳聚糖具有很高的生物相容 作者简介：过琴媛（１９５１－），女，医学生物学高级工程师，主要从事疫 性和诸如促进伤口愈合、抗菌等多种生物功能，许多 苗生产管理和质量控制。 研究者将其用作生物材料。在组织工程领域，甲壳 维普资讯 http://www.cqvip.com ７４ ２００７年第３５卷第１期Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｅｂ．２ ｏ７ ： ： 质及其衍生物也被用作细胞培养支架材料。用壳聚 糖制备的细胞培养微载体已见报道 。 ２．５海藻酸盐 海藻酸被广泛用作药物控释材料以及蛋白质、 细胞和ＤＮＡ的固定材料。它可以被生物体完全吸 收，无不良反应。有研究表明，培养在海藻酸盐载体 上的软骨细胞可以合成与天然软骨相似的细胞外基 质 。ｔ引。 ３ 微载体的分类 ３．１固体微载体 目前，实际广泛应用的是固体微载体，包括实心 球体微载体和大孔微载体。实心微载体利于细胞在 微珠表面贴壁、铺展和病毒对细胞的感染 ，放大 过程中球转球接种工艺Ｌ６ 等，以Ｃｙｔｏｄｅｘ系列应用 最广。其中Ｃｙｔｏｄｅｘｌ、Ｃｙｔｏｄｅｘ２为了便于细胞吸附 和生长其表面都具有特殊的小电荷分子；Ｃｙｔｏｄｅｘ３ 在微载体的表面覆盖一层胶原蛋白以更接近机体内 环境。这种微载体细胞贴壁快、生长快，且能长时间 培养。但实心微珠相对于利用微珠内部来培养细胞 的大孔微载体，其比表面积和可获得的细胞浓度皆 较小，细胞易受搅拌、珠间碰撞、流动剪切力等动力 学因素破坏。大孔微载体Ｃｙｔｏｐｏｒｅ则克服了上述弊 端，这种微载体以纤维素为基质，内部有许多网状的 相互连通的小孔通向载体表面，细胞在接种后，容易 进入 微载体内部生长分裂，从而避免剪切力或气泡 的影响，既使大部分细胞免受机械损伤，又为细胞 提供了充分的生长空间。这种微载体可广泛用于填 充床、流化床、搅拌釜生化反应器，且在灌流反应器 中可保持数月的良好生产力，能在降低培养基血清 含量的同时保证细胞和目的产物的产量【７】，但它在 空间上阻碍了氧等营养成分的传递和病毒对细胞的 感染，并使代谢废物在其中累积 】。 ３．２液体微载体 鉴于固体微载体的不足，Ｃｈａｒｉｅｓ等开发了氟碳 化合物液膜微载体。这种液体微载体的微珠形成、 细胞贴壁、培养均在搅拌下进行，当达到培养目的时 停止搅拌即可通过离心分相使细胞游离悬浮于有机 相和培养基相之间，用移液管即可方便移出 】，克 服了固体微载体吸附血清、容易变性且仅一次性使 用、培养后分离过程的细胞损失等缺点。 液体微载体尚存在某些不足，如成本高、制作工 艺复杂、部分微载体不能重复使用等，但随着新的微 载体制作材料的开发及对其结构的设计改进，这类 微载体的优势日渐显露。ＨｖＣｌｏｎｅ公司生产的Ｃｕ— ｈｉＳｐｈｅｒ—Ｓ以明胶为基质而制成，具有表面积大、热 稳定性强、耐高压灭菌、易于消化分离细胞等特点， 为动物细胞培养带来了更多的方便。 ４ 微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 针对微载体细胞培养的限制性因素，为提供低 剪切力、高效率氧传递、易于细胞传代等适宜的外部 环境，应用生物反应器系统进行微载体大规模细胞 扩增具有明显优势。目前国外相继研制了数种适合 进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如 搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统及 灌注式生物反应器系统等。 ４．１搅拌式生物反应器系统 最简单的生物反应器系统即为搅拌式生物反应 器系统。该系统在旋转培养瓶的瓶底放置磁力搅拌 棒，通过磁力搅拌，使微载体在培养基中基本上达到 均匀分布。搅拌式生物反应器系统在微载体大规模 细胞扩增研究领域的应用中已有较长的历史，但因 该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制 了其应用范围。尽管如此，由于该系统具有简单、实 用及价格低廉等特点，应用该系统进行组织工程种 子细胞大规模扩增国内外仍有不少成功的研究报 道。例如，Ｗｅｔｌｌｅｒ ２０００年就成功地在该系统内进行 了肝细胞大规模扩增的研究。 ４．２灌注式生物反应器系统 搅拌式生物反应器系统尽管存在很多优点，但 机械搅拌会带来不需要的剪切力。为了消除这种不 利因素，国外常采用灌注式生物反应器系统来进行 微载体大规模细胞培养研究。灌注培养是目前细胞 工程领域研究热点之一，它的特点是不断地加人新 鲜培养基，以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗 培养基，使细胞在一个相对稳定的生长环境内增殖， 既省时省力，又减少了细胞被污染的机会，且可以提 高细胞密度ｌ０倍以上。目前，采用灌注培养的细胞 密度已达到１×１０ Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，而人体细胞密度是（２ ～３）×１０。Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ【】。。，因而应用该系统进行微载 体大规模细胞扩增仍有巨大的开发潜力。 ４．３旋转生物反应器 近年来，旋转生物反应器系统（ＲＣＣＳ）已经成 为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常 用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为 模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。 ＲＣＣＳ既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在 其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体¨¨。 该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移人 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年第３５卷第１期Ｐｒｏｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍ叨０ 曼 ！ ： ：箜 ： ７５ ＲＣＣＳ圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容 器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水 平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋 转且不与容器壁和其它物体相撞。由于系统无推进 器、气泡或搅拌器，使破坏性应力减到最小。在 ＲＣＣＳ中的细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出 ＣＯ：。因该系统可提供破坏性应力很低的细胞生存 （系）的无血清、无蛋白培养基；④将生物力学和材 料科学的相关成果移植于细胞工程领域，提高细胞 大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平。 参考文献： ［１］Ｈｉｌｌｅｇａｓ Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ，ＡＩｂＤＴ Ａ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｃｏａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｍｉ— ｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ Ｂｅａｄｓ［Ｐ］．ｕｓ４９９４３８８ ［２］ 刘成圣，陈西广．甲壳质及其衍生物作为贴壁依赖性动物细胞 生长微载体的研究现状［Ｊ］．海洋科学２０００，２４（１０）：２０－２２． ［３］Ｈａｕｓｅｌｍａｎｎ ＨＪ，Ａｙｄｅｌｏｔｔｅ ＭＢ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＢＬ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 环境，因此，近年来已经广泛应用于微载体系统大规 模细胞培养研究，至今已有近百种组织细胞均在该 系统内成功进行了大规模扩增ｕ引。 ５ 微载体培养细胞用于生物医药制品的生产 动物细胞的大规模培养，始于制造口蹄疫疫苗。 经过３Ｏ多年的发展，该技术已日臻成熟。利用动物 细胞大规模培养技术已经生产出了一些生物制品及 具有重要实用价值的细胞产品，如病毒疫苗、干扰 素、激素、单克隆抗体等。 商品化的微载体虽然很多，但至今没有哪一种 微载体适用于培养各种类型的细胞。选择何种类型 的微载体要从以下几个方面考虑：微载体的价格；特 殊细胞对微载体表面的特殊要求；收集细胞的方式， 是否希望将微载体溶解，比如用胰蛋白￣ＪＥＤＴＡ溶 解明胶微载体、用胶原酶溶解胶原微载体，从而得到 高质量的细胞悬浮液。经验表明，对于每种特定的 细胞系，在大规模培养之前，有必要使用几种不同的 微载体先进行小规模培养，认清不同的微载体在细 胞产量、蛋白质表达和培养寿命等方面所存在的差 别。 ６展望 理想的微载体应有利于细胞的快速附着和扩 增，有利于细胞高密度生长，不干涉代谢产物的合成 和分泌。展望未来，今后微载体系统大规模细胞培 养技术发展的总方向是：①研制细胞生长性能优良、 吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体；②研制 规模化生物反应器和剪切力小、混合性能好的新型 细胞培养系统；③设计新的适合于各个体细胞株 ａｎｄ ｔｕｍｏｖｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ａｄｕｈ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｎ￣ｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ａｌｇｉｎａｔｅ ｂｅａｄｓ［Ｊ］．Ｍａｔｒｉｘ １９９２，（１２）： １１６．１２９． ［４］Ｈａｕｓｅｌｍａｎｎ ＨＪ，Ｍａｓｕｄａ Ｋ，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ＥＢ，ｅｔ ａ１．Ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ａｌｇｉｎａｔｅ ｆｏｒｍ ａ ｍａｔｒｉｘ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｉｔｌｇａｅ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９６（２７１－Ｃ）：７４２— ７５２． ［５］Ｂｅｒｒｙ ＪＭ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｐｈｙｓｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓｆｏｒ ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｎａｄ ｏＷｔｈ ｏｎ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｍｉｏｒｏｃａｒｒｉｏｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １９９７，（６２）：１２－１９． ［６］张立，严春，范卫民，等．Ｖｅｔｏ细胞的微载体培养［Ｊ］．华东理工 大学学报１９９８，２４（６）：６５９－６６３． ［７］ Ｋｅｎｎａｒｄ ＭＬ，Ｐｉｒｅｔ ＪＭ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｐｈｅｒｏｉｄ，ｐｏｒｏｕｓ，ａｎｄ ｌｏｉｌｄ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａ— ｒｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９５。４７： ５５０－５５６． ［８］Ａｌｖｅｓ ＰＭ，Ｍｏｒｅｉｍ儿，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＪＭ，ｅｔ ａ１．Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｒｓｉｏｎａｌ ｖｅｒ－ ８Ｕ８ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｎａｌ ｃｕｔｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｒｍｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏ－ ｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｔｔｋ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６，５２：４２９－４３２． ［９］王国政．微载体细胞培养过程控制与检测［Ｊ］．工业微生物 １９９０．２：３１ ． ［１Ｏ］ 王常勇．采用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞［Ｊ］． 生物医学工程与临床２００２，６（１）：５１－５４． ［１１］Ｆｒｅｅｄ ＬＥ，Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ ＧＶ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ．Ｃｕｌｉｔｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｏｌｙ－ｎｌｅｒ ｃａｒｔｉｌｇａｅ ｉｍｐｌｎａｔｓ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｕｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９３，５１： ２５７． ［１２］Ｆｒｏｎｄｏｚａ Ｃ，Ｓｏｈｒａｂｉ Ａ。Ｈｕｎｇｅｒｆｏｒｄ Ｄ．Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｓｅ ｐｒｏ－ ｌｉｆｅｍｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｍａｔｒｉｘ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｆｉａｌｓ １９９６。１７：８７９４８８．
