使酶活力下降，但不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用（inhibition）。能引起抑制作用的物质叫做酶的抑制剂
（inhibitor）。研究抑制作用有助于对酶的作用机理、生物代谢途径、药物作用机制等深入了解。
抑制剂与酶分子上的某些必需基团反应，引起酶活力下降，甚至丧失，但并不破坏整体构象，所以不会使酶变性。造成酶变性的试剂称为变性剂或失活剂。
抑制作用根据可逆性可分为可逆抑制与不可逆抑制。不可逆抑制是指抑制剂通过共价键与酶结合，是一个不可逆反应，所以不能用透析、超滤等方法除去。
不可逆抑制剂按照其选择性，又可分为专一性与非专一性不可逆抑制剂。前者只能与活性部位的基团反应，后者可与多种基团反应。因为酶活性中心基团的化学性质常常比其它基团更活泼，所以各种试剂对两者的亲和力不同。如果抑制剂对活性部位基团的亲和力比对其它基团大三个数量级，即为专一性抑制剂。二者的区分并不是绝对的，有时会因作用对象及条件不同，而发生转化。
有机磷化合物是典型的非专一性不可逆抑制剂，它可与酶活性中心丝氨酸上的羟基牢固结合，从而抑制某些蛋白酶及酯酶（如胆碱酯酶），引起一系列神经中毒症状，如肌肉痉挛等，又称为神经毒剂。二战中使用过的DFP，邪教组织“奥姆真理教”在东京地铁中使用的沙林毒气，以及有机磷杀虫剂等都属于此类。
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