第４７卷第１期 ２０１３年１月 生 物 质 化 学 工 程 Ｂｉｏｍａｓｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏ１．４７ Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２０１３ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－５８５４．２０１３．０１．００８ ・研究报告——生物质化学品・ 没食子酸标准样品的制备与定值研究 汪咏梅 ，吴冬梅 ，张亮亮 ，徐曼 ，陈笳鸿 （１．中国林业科学研究院林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局林产 化学工程重点开放性实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京２１００４２； ２．中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京１０００９１） 摘要：研究了没食子酸标准样品的制备、均匀性和稳定性检验及其定值方法。用五倍子单宁酸水解得到的没食子酸为 原料，经精制得到高纯度的没食子酸标准样品。通过红外光谱、核磁共振、热重分析证实该标准样品的化学结构式。标 准样品含量测定采用高效液相色谱面积归一化法，并通过了均匀性检验和稳定性检验（１５个月）。经６个实验室的联合 定值，没食子酸标准样品的含量值为９９．９６％±０．１０％。 关键词：没食子酸；标准样品；定值；均匀性检验；稳定性检验 中图分类号：ＴＱ３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—５８５４（２０１３）０１—００４９—０５ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ Ｇａｌｌｉｃ Ａｃｉｄ ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇ—ｍｅｉ ，ＷＵ Ｄｏｎｇ．ｍｅｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ－ｌｉａｎｇ ，ＸＵ Ｍａｎ ，ＣＨＥＮ Ｊｉａ．ｈｏｎｇ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡＦ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ．ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｓｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｋｅｙ ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｌａｂ．ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳＦＡ；Ｋｅｙ Ｌａｂ．ｏｆ Ｂｉｏｍａｓｓ Ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｙ，ｒＣＡＦ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉｌ ｏｆ ｇａｌａｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｉｒｌ ｇｒａａｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｒｅｃｒｙｓｔｌｌｉａｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＩＲ，ＮＭＲ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ａｒｅａ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉｌ ｏｆ ｇａａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｐａｓｓｅｄ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅ－ ｎｅｉｔｙ，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｔｂｌａｅ ｗｉｔｈｉｎ １５ ｍｏｎｔｈｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｔｈｅ ｓｔｎｄａｒｄ ｖａａｌｕｅ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ９９．９６％±０．１０％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ；ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｔｅｓｔ；ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ 没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ），亦称桔酸，化学名３，４，５一三羟基苯甲酸（３，４，５－ｔｒｉｈｙｄｒ０ｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）。没 食子酸广泛存在于植物体中。没食子酸是一种具有多种用途的化工原料，可作为制备多种药物的中间 体，制备多种没食子酸烷基酯抗氧化剂，制备焦性没食子酸及其衍生物产品用于制药工业、电子工业等 领域。 没食子酸含量是各种规格没食子酸产品的主要技术指标，采用紫外分光光度法测定，需要没食子酸 标准样品 ］。此外，进行多种植物化学成分研究时，常涉及没食子酸及其相关联的化学成分的定性和 定量检测，也需要没食子酸标准样品。标准样品是标准化工作的重要组成部分，是技术监督工作的重要 实物参照依据。用于化学成分分析的标准样品，必须具有准确的标准值、均匀性和稳定性。本文作者主 要开展了没食子酸目标样品的提纯制备、含量测定、化学结构鉴定、均匀性检验、稳定性检验以及多个实 验室联合定值等研究工作。 收稿日期：２０１２—０９—０１ 基金项目：科技基础性工作专项（２００７ＦＹ２３０２００） 作者简介：汪咏梅（１９６４一），女，浙江义乌人，副研究员，从事植物资源化学利用研究；Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｊｌｈｓｗｙｍ＠１６３．ｃｏｍ。 ５０ 生物质化学工程 第４７卷 １ 实验 １．１材料、试剂与仪器 没食子酸：工业品，张家界奥威科技有限公司；活性炭，氢氧化钠，ＥＤＴＡ二钠：分析纯；水为一级水。 ＦＤ一１型冷冻干燥机，日本ＥＹＥＬＡ公司；ＩＳ１０傅里叶变换红外光谱仪，美国尼高力公司；２０９Ｆ１同步热分 析仪，德国耐驰公司；ＡＶ一３００核磁共振光谱仪，德国Ｂｒｕｋｅｒ公司；ＬＩＢＲＯＲ ＡＨＬ一２００型电子天平，日本 岛津公司。ＬＣ一２０ＡＢ型高效液相色谱仪，日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司。 １．２标准样品的制备与鉴定 １．２．１标准样品的制备将工业没食子酸原料加水、加温至完全溶解，加入经净化预处理过的活性炭 和ＥＤＴＡ二钠进行精制，热抽滤，冷却结晶。将晶体再重结晶，抽滤后冷冻干燥得到高纯度的没食子酸 样品。制备得到白色针状晶体的目标样品５００ ｇ。样品经研磨、混合均匀后缩分，装入带塞棕色玻璃瓶 内，分装１００瓶，每瓶装５ ｇ。 １．２．２ 鉴定通过红外光谱分析、核磁共振波谱解析来证实制备的没食子酸标准样品的化学结构。通 过无水硫酸铜试验和热重分析判断没食子酸中结晶水的存在。 １．３没食子酸标准样品的检验与定值 １．３．１含量测定方法没食子酸标准样品是用作没食子酸化学成分含量测定的标准参照物，因此确定 样品中没食子酸含量值为标准样品的特性值。用高效液相色谱法面积归一化法测定标准样品中没食子 酸的含量。试液配制：标准品在１０５ ｏＣ±２℃下烘干至恒重后，称样量为０．１ ｇ，精确到０．０００ １ ｇ，用蒸 馏水配置到１００ ｍＬ。高效液相色谱法测定条件：色谱柱Ｉｎｅｒｔｅｘ，Ｃ１８ １５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ ｍ；流动相为 甲醇一水（含０．１％磷酸）＝２：８（ｍＬ：ｍＬ）混合液；流速１ ｍＬ／ｍｉｎ；温度４０ ｏＣ；紫外检测波长２６３ ｎｍ；试 液浓度１ ｇ／Ｌ；进样量１２ Ｌ。 １．３．２均匀性检验、稳定性检验、定值按照《标准样品工作导则（３）标准样品定值的一般原则和统 计方法》 Ｊ，采用Ｆ检验法对样品进行均匀性检验；每隔一定时间，抽样检测含量，用直线作为经验模式 进行稳定性研究；在样品通过均匀性和稳定性检验合格后，进行多实验室联合定值；通过合成测定、均匀 性、稳定性对特性值总不确定度的贡献来估计扩展不确定度。 ２结果与讨论 ２．１化学结构表征 ２．１．１红外光谱分析 目标样品的红外（ＩＲ）光谱图见图１。 由红外图谱看出：３２６１ ｅｍ 为羟基自由基（一ＯＨ）的伸缩振 动吸收峰，２５００～３０００ ｃｍ 为羧基（一ｃＯＯＨ）的伸缩振动吸 收峰，１６９３．７３ ｃｍ 为羰基（Ｃ＝Ｏ）吸收峰，１６１１．９８ ｅｍ。。处 为苯环（Ｃ－￣－－Ｃ）的伸缩振动吸收峰。谱图与文献 没食子酸 红外光谱图吻合。 ２．１．２核磁共振波谱解析 目标样品的核磁共振数据如下： Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ—ｄ ，ＴＭＳ）６：１２．１８７（１Ｈ，ｓ， 一４００ｏ ３５００ ３００ｏ ２５ｏ０ ２０００ １５ｏｏ ｌＯＯＯ ５００ 波数／ｃｍ一 图１样品的红外光谱图 Ｆｉｇ．１ ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｃＯＯＨ）为羧基氢信号，９．１８７（２Ｈ，ｓ，一ＯＨ）为２个对称的酚 羟基氢信号，８．８１４（１Ｈ，Ｓ，一ＯＨ）为酚羟基氢信号，６．９２４（２Ｈ， ｓ，一ｃＨ一）为２个对称的芳香氢信号。 ３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ—ｄ６），６：１０８．７３（Ｃ一２，６），１４５．３４ （Ｃ一３，５），１２０．４２（Ｃ一１），１３７．９５（Ｃ－４），１６７．４７（－－ＣＯＯＨ），数据与文献 报道的没食子酸的谱学数据 第１期 汪咏梅，等：没食子酸标准样品的制备与定值研究 ５１ 相一致，核磁共振氢谱见图２，碳谱见图３。 一 量＾ ｌｌ ｌ ｌ ｌｌ ｆＩ ＩＩ ｌ ｌ ｌ ● ｌ １５ １０ ５ ０ ２ｏｏ １８Ｏ １６Ｏ １４０ １２０ １００ ８Ｏ ６０ ４Ｏ ２Ｏ Ｏ 图２样品的 ＨＮＭＲ谱图 图３样品的 ３ｃ ＮＭＲ谱图 Ｆｉｇ．２ Ｈ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ｆｉｇ．３ ３ｃ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ２．１．３ 热重分析（ＴＧ） 目标样品经无水硫酸铜检验未观察 到颜色变化，证明样品中游离水分可忽略不计。目标样品的热 重分析变化曲线见图４，随着加热温度的的升高，样品的质量 发生变化。由目标样品的加热失重变化数据计算得到，样品在 ７４～１１４℃质量减少９．６％，相当于失去１个结晶水的质量； ＩＩ４—２５９℃质量基本没有变化；在２５９～３１７℃质量减少 ２４．５％，相当于失去１个二氧化碳的质量，说明在该温度阶段 发生脱羧反应，３１７℃后质量继续减少，说明化合物发生分解 炭化。由此可判断目标样品的化学结构中含有１个结晶水。 图４样品的热重分析曲线 根据以上检测分析，本次制备的没食子酸标准样品符合右 Ｆｉｇ．４ ＴＧ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ 边的化学结构。 ２．２样品的均匀性检验 Ｈ ＣＯＯＨ‘Ｈ２０ 目标样品均匀性检验、稳定性检验以及多个实验室特性值 联合定值过程中，均采用高效液相色谱面积归一化法进行含量 测定，目标样品含量测定的高效液相色谱图见图５。 按标准样品工作导则，采用Ｆ检验法对目标样品进行均匀 性检验。从上述制备的１００瓶分装样品中随机抽取１５瓶，进行 没食子酸含量测定，每瓶重复测４次。均匀性检验数据见表１。 ．５２ 生物质化学工程 第４７卷 ｌ ６ｌ ｌ＜ ０ ９５． ２‘ （６１） 故斜率变化是不显著的，未观测到不稳定性。检验结果表明：目标样品的没食子酸含量在１５个月 内是稳定的。 表１ 目标样品没食子酸含量的均匀性检验数据 Ｔａｂｌｅ １ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ％ ２．４样品的多实验室联合定值 在目标样品通过均匀性和稳定性检验合格后，进行多实验室联合定值。选取水平相当的６个实验 室（实验室１：江苏省理化测试中心；实验室２：中国林业科学研究院林产化学工业研究所分析测试中心； 实验室３：国家林业局林化产品质量监督检验站；实验室４：上海市质量监督检验技术研究院；实验室５： 上海天祥质量技术服务有限公司；实验室６：研制单位：中国林业科学研究院林产化学工业研究所植物 提取物研究室），向每个实验室提供２个单元，采用统一的测试方法，每单元进行３次重复测量目标样品 的特性值，数据见表３。 第１期 汪咏梅，等：没食子酸标准样品的制备与定值研究 ５３ 平均值ａｖｅｒａｇｅ 计算所有实验室的总平均值Ｘ＝９９．９６％，实验室间平均值的标准偏差Ｓｙ＝０．０２５。６个实验室 Ｇｒｕｂｂ’Ｓ统计量Ｇ分别为：０．４００、１．２００、０．４００、０．８００、１．６００和０．４００。查表获得Ｇｒｕｂｂ’ｓ检验临界 值：在测量次数ｎ：６，显著性水平为ｌ％时，Ｇ临界值为１．９７３；在测量次数ｎ：６，显著性水平为５％ 时，Ｇ临界值为１．８８７。由于６个实验室的Ｇｒｕｂｂ’ｓ统计量Ｇ均小于１．９７３和１．８８７，因此上述６个实验 室获得的检测数据都有效。 扩展不确定度通过合成测定、均匀性、稳定性对特性值总不确定度的贡献来估计。 定值统计平均值的不确定度：“ ： ＝０．ｏ２５／￣＝０．０１１ 式中：Ｐ一实验室数。 瓶间不均，匀性不确定度：ｕｂ２ｂ＝（ＭＳ问一ＭＳ内）／ｎ０＝（３．０９—１．９５）×１０～／４＝２．８５×１０ 特性值的长期不稳定引起的不确定度：“Ｉｆｓ＝ ・ｔ＝ （ｂ。）・ｔ＝０．００２ ６９６×１５＝０．０４０ 短期稳定性不确定度ｕ 可忽略不计。 目标样品特性值（没食子酸含量）的合成不确定度： ／＇／＇ＣＲＭ：√ｕ：， １ｈ ＋ ｂ＋ ＾ １ ＋ １ ： ０．０１１ ＋２．８５×１０一。＋０．０４０ ＝０．０５ 扩展不确定度：Ｕ ＝尼×０．０５＝０．１０（取包含因子ｋ＝２） 没食子酸标准样品含量标准值±不确定度（９５％置信水平）＝９９．９６％一－Ｉ－０．１０％。 ３结论 ３．１ 经过提纯制备获得的目标样品，通过红外光谱、核磁共振氢谱数据和热重分析等方法，确定其化学 结构为具有１个结晶水的没食子酸。 ３．２没食子酸含量测定使用高效液相色谱方法（面积归一化法）。目标样品通过均匀性检验和稳定性 检验，检验结果表明，目标样品是均匀的，在１５个月内的没食子酸含量值是稳定的。目标样品经过６个 实验室联合定值，其没食子酸含量的标准值为９９．９６％，扩展不确定度（ｋ＝２）为０．１０％。 参考文献： ［１ Ｊ中华人民共和国林业行业标准，ＬＹ／Ｔ １６４４—２００５＜（没食子酸分析试验方法》［ｓ］． ［２］ＧＢ／Ｔ １５０００．３—２００８标准样品工作导则（３）标准样品定值的一般原则和统计方法［ｓ］． ［３］宗水珍．苦黄注射液中乙酸乙酯萃取物成分表征［Ｊ］．理化检验——化学分册，２０００，３６（１２）：５４７—５４８，５５０ ［４］高雯，沈阳，张红军等．委陵菜的化学成分研究［Ｊ］．药学服务与研究，２００７，７（４）：２６２—２６４． ［５］中国标准化协会全国标准样品技术委员会．标准样品实用手册［Ｍ］．北京：中国标准化出版社，２００３年．
