宫颈癌相关基因DNA甲基化研究进展

宫颈癌相关基因DNA甲基化研究进展

作者：李恬 唐良萏 黄晓斌 来源：《中外医学研究》2013年第05期

【摘要】 近年研究发现宫颈癌的发生发展可能与表观遗传的改变有很大联系。DNA甲基化是表观遗传学重要的分子机制之一。近年来，国内外对宫颈癌DNA甲基化的研究越来越多，发现多种基因在宫颈癌的发生发展中发生了甲基化修饰，且这种表观遗传学改变与宫颈病变程度有一定相关性。许多研究提出宫颈癌有关的DNA甲基化检测可能用于临床宫颈癌和癌前病变的诊断或预测。

【关键词】 DNA甲基化； 宫颈癌； 生物标志物

中图分类号 R711.7 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）5-0150-05

宫颈癌（cervical cancer）是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1-2]。传统上癌症的发生发展被视为一种遗传疾病，表观遗传学机制对于组织特异性基因表达模式的维护和正常发展十分必要，表观遗传学受到破坏将导致基因功能改变及细胞恶性转化。表观遗传学（epigenetics）是与遗传学（genetics）相对应的概念。遗传学改变是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学是研究不涉及DNA序列的改变，但基因表达却发生了可遗传的改变的学科。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生改变的结果，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。除基因组的改变外，近年研究发现宫颈癌的发生发展可能与表观遗传的改变有很大联系。表观遗传的现象很多，已知的有：DNA甲基化、组蛋白乙酰化、RNA干扰、基因组印记（genomic impriting）和DNA编辑（RNA editing）、基因沉默、核仁显性和休眠转座子激活等。其中DNA甲基化作为表观遗传学重要的分子机制之一，受到人们越来越多的关注[3-4]。基因组正常而甲基化模式改变与肿瘤的演变发展有着密切联系[5]。 1 DNA甲基化

DNA甲基化是表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容，在调控基因表达及染色体结构方面发挥着重要作用。在哺乳动物基因组中，所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNA methytrasferase）的作用下将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳原子上，生成5’-甲基胞嘧啶的过程。人类基因组序列中的CpG二核苷酸分布并不均匀，主要以两种形式存在：一种分散在DNA序列中，约70%总是处于甲基化状态，可称为甲基化CpG位点，如alu等重复序列；另一种则富含CpG DNA短序列，以CpG岛的形式存在或以大量重复序列区域存在（如着丝粒重复序列、反转录转座子元件、rDNA等）。CpG岛大小为300～3 000 bp左右，且富含非甲基化的CpG二核苷酸。这些CpG岛虽然仅占基因组DNA的1%～2%，但其通常位于基因的转录起始位点附近（启动子或第一外显子区域，人类基因启动子中的60%有CpG岛），可能参与基因的表达调控，因而受到人们的广泛关注，特

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别是一些组织特异性CpG岛甲基化异常高，致抑癌基因转录失活，使抑癌基因表达沉默，而甲基化异常低，致原癌基因激活，从而诱发细胞癌变[6-7]，这些已经成为肿瘤研究中的热点问题。而DNA甲基化对无CpG岛启动子的调节也很重要，如MASPIN的组织特异性表达，其启动子无CpG岛，但表达受到DNA甲基化调控。 2 DNA甲基化与宫颈癌

近年来，国内外对宫颈癌DNA甲基化的研究越来越多，研究发现多种基因在宫颈癌的发生发展中发生了甲基化修饰，且这种表观遗传学改变与宫颈病变程度有一定相关性。研究者采用多种方法分析了宫颈脱落细胞、宫颈活检组织和血浆标本等，还提出DNA甲基化可能用于宫颈癌筛查[8-18]。 2.1 CDH13的甲基化

CDH13（Cadherin 13，又称作H-cadherin，P105）是钙粘蛋白家族的一种非典型成员，缺乏跨膜区和固定在细胞膜外表面上的糖基锚，CDH13参与细胞黏附和转移过程[19]。在癌细胞中，CDH13常常下调，这种下调与多种癌症预后较差有关，如肺癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌[20]。由于异常甲基化，钙介导的细胞黏附系统失活，而这种失活在人类癌症中被普遍发现，Widschwendter等[10]通过研究宫颈癌患者的血清标本中CDH13甲基化状态发现甲基化阴性的预后更好，CDH13异常甲基化检测也许可用于筛选有复发高危风险的宫颈癌患者，这将有利于对这种患者进一步治疗。Nabiha等[18]研究发现从CIN1到宫颈癌，CDH13的启动子甲基化频率逐步增加（P 2.2 CDH1的甲基化

CDH1（cadherin 1，又称作E-cadherin，UVO，ECAD，LCAM，Arc-1，CD324）是上皮型钙粘附素中的一种，其基因为一种肿瘤抑制基因，CDH1甲基化可能导致E-钙粘蛋白表达下调或无表达。Widschwendter等[10]研究发现宫颈癌患者的血清标本中CDH1甲基化阴性的无病生存率显著好于甲基化阳性患者，CDH1异常甲基化检测也许也可用于筛选有复发高危风险的宫颈癌患者。Abuduradeer等[21]分析宫颈癌和无恶性疾病患者血清样本的研究也证实CDH1甲基化分析可能是一个潜在的预测宫颈癌的指标。Pathak等[22-23]一项一碳代谢在宫颈癌进展中的重要性的研究表明，低叶酸和维生素B12状态与HPV病毒感染有关；从正常到瘤样病变到宫颈癌，CDH1、HIC1和RARβ的启动子甲基化频率逐步增加（P 2.3 DAPK1的甲基化

以色列科学家Adikimchi于1995年在基因组中扫描启动细胞凋亡的基因和抑癌基因时发现了死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase-1，DAPK1）[24]。DAPK1是一种与凋亡有关的钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其基因是一个与多种细胞死亡相关信号通路相联系的肿瘤抑制基因，目前大量研究发现DAPK1的基因启动子的变异性高度甲基化改变

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出现在多种肿瘤中。2009年，Wentzensen等[13]对Medline中的51项研究文献进行综合分析发现，宫颈癌组织中基因甲基化现象广泛存在，其中DAPK1、CADM1、RAR-β在5项或超过5项的研究中始终显示出甲基化增高。Kim等[25]对甲基化检测用于宫颈癌筛查的可行性研究表明DAPK1、RASSF1A、RAR-β等8个基因甲基化程度随着宫颈病变程度增加而越来越严重，它们在正常宫颈、LSIL、HSIL及SCC中的甲基化频率明显不同（P 2.4 CADM1的甲基化

Apostolidou等[23]对HSIL及阴性对照的液基细胞样本采用荧光定量MSP方法研究了28个基因，发现CADM1、HOXA11及SOX1这3个基因的甲基化水平明显变化。CADM1（cell adhesion molecule 1）又称作BL2，ST17，IGSF4，NECL2，RA175，TSLC1，IGSF4A，Necl-2，SYNCAM，sgIGSF，sTSLC-1，synCAM1，是2001年Kuramochi等研究人类肺癌时发现的一个位于人类染色体11q23.2处的肿瘤抑制基因，研究表明CADM1参与细胞骨架构建和维持细胞的黏附功能的稳定，当CADM1失活时就会引起肿瘤转移和侵袭[26-27]。Hesselink等[28-29]研究均表明在高危型HPV感染妇女中联合检测CADM1和MAL启动子甲基化可作为一种可选择的筛查宫颈癌的分子工具。 2.5 HOXA11的甲基化

Hox基因（homeotic genes）全名同源基因或同源异型基因，有着与细胞增殖、凋亡和分化有关的多种功能，其编码的转录因子在调控生物形体形成过程中发挥重要作用，一些Hox基因在不同的肿瘤细胞中有异常表达，Hox基因的表达调控机制主要是通过表观遗传学控制[30]。HOXA11属于同源异型盒（homeo-box）家族中的一员。Apostolidou等[23]在液基细胞样本中DNA甲基化分析的研究中提出HOXA11对宫颈癌发展十分重要，是一个潜在有用的分子标记物。

2.6 TWIST1的甲基化

TWIST1又称作SCS、ACS3、CRS1、BPES2、BPES3、TWIST、bHLHa38。TWIST1是一个基本的螺旋环螺旋（bHLH）转录因子，1988年由Shelton等[31]在果蝇身上首次确定，为果蝇中胚层形成的一个关键调节因子，有调节细胞的增殖、迁移和分化的作用。TWIST1转录因子可诱导上皮间质转变（EMT）和侵袭伪足形成从而促进肿瘤转移[32]。虽然Feng等[33]研究认为使用一组三个候选基因（DAPK1，RAR-β，TWIST1）甲基化检测子宫颈癌可获得高达74%的敏感性和95%的特异性，但Wentzensen等[13]审查后支持进一步评估DAPK1和RAR-β这两个基因。2011年，Nabiha等[18]研究发现随着宫颈病变程度加重，TWIST1的启动子甲基化频率逐步增加，认为其启动子甲基化是引起宫颈肿瘤发生的一个早期事件。 2.7 RAR-β的甲基化

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维甲酸受体-β（retinoic acid receptor beta，RAR-β）又称作HAP、RRB2、NR1B2，是核转录调节剂甲状腺激素受体超家族成员，通过调节基因的表达，限制多种类型细胞生长。早在2001年，Virmani等[34]研究了不同宫颈病变阶段的异常甲基化模式，测定了6个基因（p16、RAR-β、FHIT、GSTP1、MGMT、hMLH1）的甲基化状态，文章指出，随着宫颈病变病理程度加重，这些基因的甲基化程度也呈现上升趋势，其中RARβ和GSTP1的甲基化为早期事件，p16和MGMT的甲基化为中期事件，FHIT的甲基化为与肿瘤有关的晚期事件；且认为甲基化发生独立于其他危险因素，异常甲基化模式可有助于确定病变进展风险。Kim等[25]研究表明RAR-β的甲基化程度随着宫颈病变的严重程度而上升，且RAR-β/Twist/MGMT三个基因联合检测能更好的区分HSIL/SCC与LCIS/阴性，三联一体检测HSIL/SCC的特异性为82.2%，敏感性为78.7%。2012年Pathak等[22]的研究文章再次表明RARβ的启动子甲基化频率随着宫颈病变程度逐步增加，可作为评估宫颈癌风险的潜在生物标志物。 2.8 CDKN2a的甲基化

CDKN2a（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A）是一个重要的肿瘤抑制基因，又称作P16INK4a等（ARF、MLM、p14、p16、p19、CMM2、INK4、MTS1、TP16、CDK4I、CDKN2、INK4A、MTS-1、p14ARF、p19ARF、p16INK4、p16INK4A、p16-INK4A），编码的蛋白为CDK4的抑制剂，是细胞周期调控与癌症关系中最直接联系的一种肿瘤抑制蛋白，p16INK4a基因在人类多种肿瘤中经常失活[35]。Murphy等[36]研究认为p16INK4a是预测宫颈癌的一个生物标志。Ivanova等[37]的研究文章指出：既往的研究已经用甲基化特异性PCR证明了在25%～57%的宫颈癌组织中P16INK4a启动子的超甲基化，但宫颈癌中p16INK4a的5’-CpG的超甲基化并不经常发生，因此不能作为一个有效的癌细胞标记。针对P16INK4a甲基化是否能用作宫颈病变的一个生物标志物，Furtado等[38]研究结果为HSIL组中55.6%细胞学样品检测到p16INK4a启动子甲基化，而仅仅20%的正常细胞学样品检测到p16INK4a启动子甲基化，并认为p16INK4a启动子甲基化与HPV是否存在无关。Spathis等[39]指出：虽然持续高危型HPV感染被认为是引起宫颈癌发生的最重要危险因素，但只有不到5%的感染者最终发生为宫颈癌，表明还有其他分子事件引起宫颈癌发生。他们在液基细胞学样本中分析了p16、MGMT、hMLH1的启动子甲基化情况，结果从良性病变到恶性病变，3个候选基因的启动子甲基化通常都被检测到，研究者认为需要更多的数据来确定这些基因的甲基化状态在宫颈病变中的价值。看来对于p16INK4a甲基化与宫颈病变的关系还有待探讨。 2.9 RASSF1的甲基化

Ras相关区域家族成员1[Ras association（RalGDS/AF-6）domain family member 1，RASSF1]又称作123F2、RDA32、NORE2A、RASSF1A、REH3P21，是一种肿瘤抑制基因，该基因丢失及表达改变与多种癌症的发病机制有关。RASSF1基因的CpG岛启动子区域的超甲基化与该基因失活有关。该基因编码的蛋白与诱导细胞周期阻滞有关。RASSF1A甲基化程度随着宫颈病变程度增加而呈上升趋势，在正常宫颈、LSIL、HSIL及SCC中的甲基化频率明显不同（P

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2.10 SOX1的甲基化

SOX1[SRY（sex determining region Y）-box 1]编码SOX家族转录因子之一，参与调节胚胎发育和决定细胞存亡。2008年Lai等[41]的研究将SOX1作为可能用于宫颈癌筛查的DNA甲基化标志物之一。研究者报道了6个基因（SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1及ONECUT1）在宫颈癌组织中有着更加频繁的甲基化频率（81.5%、94.4%、89.9%、80.4%、77.8%和20.4%），相应地，正常对照组组织中这些基因的甲基化频率分别为2.2%、0、6.7%、11.9%、11.1%和0（P 2.11 HPV16、18 DNA的甲基化

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染与宫颈癌之间有十分密切的关联，但其诱导宫颈癌变发生的分子生物学机制尚不明确。乳头瘤病毒家族有超过100个不同的家族成员，与人类有关的大部分导致各种良性增生，但是HPV16、18是两个特别的高危类型，其感染与90%的宫颈癌有关，与>50%的其他肛门生殖器肿瘤有关，与一小部分头颈部肿瘤有关[43]。2009年Fernandez等[44]在他们的研究文章中提供了第一个完整的与人类癌症有关的双链DNA病毒DNA甲基化谱，为研究这些病毒的致癌机理提供了重要线索。研究者使用亚硫酸氢钠基因组测序的多个克隆，获得了人类乳头状瘤病毒16和18和人类B型肝炎病毒基因组中的每一个CpG二核苷酸的DNA甲基化状态，还有Epstein-Barr病毒的所有转录起始位点；研究发现这些病毒的DNA甲基化状态随着疾病进展由没有甲基化向高度甲基化演变，与疾病从无症状的健康携带状态到通过长期感染发展到癌前病变，最终发展为完全的侵袭性肿瘤的过程有关。Brandsma等[45]研究发现HPV16 CpGs没有甲基化或很少的甲基化与细胞学检查阴性有关，E1和E6的低水平甲基化与宫颈低度病变有关，E5/L2/L1区域的许多CpGs高水平甲基化与宫颈高度病变有关，和病理诊断比较，两个评估定级方法有着高度的一致性。研究者认为在临床的宫颈细胞样本中进行HPV16 DNA甲基化分析将确定不同的甲基化模式，这些模式大样本研究后将可能作为宫颈癌进展的生物标志物。Sun等[46]研究表明HPV16 L1 ORF的CpG位点甲基化增加与CIN3+有关，因此可能是一个宫颈癌及癌前病变筛查的生物标志物。Turan等[47]研究发现HPV-18 L1在宫颈癌中总是高度甲基化，而在无临床症状的患者中经常表现为低甲基化或无甲基化。在癌前病变中，HPV-18 L1甲基化程度与病变程度有关。研究者建立了敏感快速的甲基化定量PCR检测方法，期望将检测HPV-18 L1甲基化开发为可用的HPV-18感染后致癌过程中的生物学标记物。Clarke等[48]文章写道最近的研究表明HPV DNA甲基化检测可从那些有高危HPV感染但没有证据提示为CIN2+的患者中区分出CIN2+患者；研究者认为HPV DNA甲基化可作为一个潜在的预测或诊断宫颈癌的生物学标记物，可用于有发生宫颈癌风险的HPV感染人群。Patel等[49]研究发现较低的HPV16甲基化水平和较高的候选基因甲基化水平与更高的异常细胞学概率有关，所以甲基化在宫颈癌筛查中的作用还需进一步研究澄清。 3 展望

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肿瘤的产生既有内因，也有外因。在人类对宫颈肿瘤产生机制的研究过程中，涉及到了HPV及一些基因的研究，这些研究结果在揭露致病机制的同时，也可反应其为与肿瘤有关的筛查指标。DNA甲基化是一种基因外修饰，不改变DNA的一级结构；它在细胞正常发育、基因表达模式及基因组稳定性中起着至关重要的作用[50]。基因启动子区域的DNA甲基化的影响与基因丧失功能的突变相似[51]。越来越多的研究已经清楚地证明甲基化改建参与癌症启动和进展。目前对宫颈癌有关的DNA甲基化研究众多，本文不能一一道尽，对探讨宫颈癌发病机制和治疗方法有重要意义，许多研究提出宫颈癌有关的DNA甲基化检测可能用于临床宫颈癌和癌前病变的诊断或预测，但尚未真正筛选出可满足临床实践需要的最适合的甲基化标志物。 参考文献

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