安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２０１１ Ｓｅｐ；４６（９） ・９０５・ 蜂毒素对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其部分机制 王朋景，李俊，黄艳，吴宝明 摘要 目的探讨蜂毒素对人肝癌ＨｅｐＧ－２细胞株裸鼠移植 瘤的抑制作用。方法建立人肝癌ＨｅｐＧ－２细胞裸鼠皮下移 植瘤模型，随机分为模型组、蜂毒素组（１、２、４ ｍｇ／ｋｇ）和氟尿 嘧啶（５一ＦＵ，２ ｍｇ／ｋｇ）组，各组腹腔注射给药１０ ｄ，用药结束 后隔天处死动物。观察蜂毒素腹腔注射对人肝癌细胞在裸 鼠体内生长的的影响，计算各组裸鼠肿瘤的大小、瘤重及脾 指数。ＥＬＩＳＡ法检测裸鼠血清白介素一１（ＩＬ－１）及肿瘤坏死因 子一 （ＴＮＦ— ）。ＴＵＮＥＬ法检测裸鼠移植瘤细胞凋亡情况。 结果蜂毒素（１、２、４ ｍ ｋｇ）组的抑瘤率分别为４１．２％、 ６０．９％、７１．０％，蜂毒素各剂量组肿瘤体积显著小于模型组， 而血清ＩＬ－１和ＴＮＦ． 水平显著高于模型组，与模型组比较， 蜂毒素（２、４ ｍｇ／ｋｇ）组肿瘤组织细胞的凋亡指数显著升高 （Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０，０１）。结论蜂毒素能明显抑制人肝癌细 胞ＨｅｐＧ一２细胞裸鼠移植瘤的生长，其作用机制可能与增强 裸鼠的免疫能力和促进肿瘤组织细胞的凋亡有关。 主题词蜂毒肽；肝肿瘤，实验性 自由词ＨｅｐＧ－２ 中图分类号 Ｒ ７３５．７；Ｒ ９６５．１ 文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２０１１）０９—０９０５—０５ 肝细胞癌恶性度高，术后易复发，是全球发病率 较高的恶性肿瘤之一。在我国癌症病死率中，肝细 胞癌占第二位，在全球占第三位…。蜂毒素是蜂毒 的主要活性成分，具有多种生物学活性。文献－２ Ｊ 报道，蜂毒素具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤等生物学效 应。体外研究 表明蜂毒素对多种肿瘤细胞具有 强烈的杀伤作用。本研究观察蜂毒素在体内对人肝 癌ＨｅｐＧ一２细胞株裸鼠移植瘤的抑制作用，并初步 探讨其可能机制。 １材料与方法 １．１ 肿瘤细胞株与实验动物 人肝癌细胞株 ＨｅｐＧ－２购自中科院上海细胞库，用含１０％热灭活 ２０１１—０４—２８接收 基金项目：安徽省自然科学基金（编号：９０４１３１４０）；高校省级优秀青 年人才基金（编号：２００９ＳＱＲ２０４３）；安徽省高校青年教师 科研资助项目（编号：２ｏｏ８ｊｑｌＯ６７） 作者单位：安徽医科大学药学院，合肥２３００３２ 作者简介：王朋景，女，硕士研究生； 李俊，男，教授，博士生导师，责任作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｊ ＠ ａｈｍｌ】．ｅｄｕ．ｃｎ 小牛血清、１００ Ｕ／ｍｌ青霉素和１００ Ｕ／ｍｌ链霉素的 ＤＭＥＭ培养液，在３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度条件下常 规培养。ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）裸鼠，ＳＰＦ级，６，１５～２０ ｇ，４～６周龄，由中国人民军事医学科学院实 验动物中心提供。 １．２主要试剂 蜂毒素由安徽省百春制药厂提供 （批号：２００９１０２２）；氟尿嘧啶（５一ＦＵ）由天津金耀氨 基酸有限公司提供（批号：１００５２２１）；台盼蓝由华美 生物工程公司提供；刀豆蛋白（ＣｏｎＡ）由美国Ｓｉｇｍａ 公司提供；二甲亚砜（ＤＭＳＯ）、四甲基偶氮唑蓝 （ＭＴＹ）由Ａｍｒｅｓｃｏ公司提供；白介素一１（ＩＬ．１）、肿瘤 坏死因子一ＯＬ（ ｒＮＦ—ＯＬ）由美国ＲＤ公司提供；ＴＵＮＥＬ 凋亡试剂盒由罗氏公司提供。 １．３方法 １．３．１人肝癌裸鼠皮下移植瘤的建立“。 取对数 生长期的人肝癌ＨｅｐＧ．２细胞，用０．２５％胰蛋白酶 消化成单细胞悬液，台盼蓝拒染实验示活细胞数＞ ９５％。生理盐水调整细胞浓度至２．０×１０ 个／ｍｌ， 按０．２ ｍｌ／只接种于ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）裸鼠左侧腋窝 皮下。３周后，移植瘤直径约０．５ ｃｍ时脱臼处死裸 鼠，无菌取瘤块制成细胞悬液接种到裸鼠体内。体 内传代两次，待肿瘤直径为０．３～０．５ ｃｍ时，将裸鼠 随机分为５组：蜂毒素［１、２、４ ｍｒ，／（ｋｇ・ｄ）］组，阳 性对照组［５－ＦＵ，２ ｍｇ／（ｋｇ・ｄ）］，空白对照组为生 理盐水，每组６只，连续１０ ｄ腹腔注射给药。停药 ２４ ｈ经眼眶静脉采血，颈椎脱臼处死裸鼠，在超净 台上取瘤块、肝、脾，检测指标。从给药开始到处死 裸鼠期间，每２天记录肿瘤的长径、短径及体重。 １．３．２肿瘤生长抑制率的计算 小鼠称重后处 死，完整剥离肿瘤，去除血污、脂肪等非肿瘤组织，称 取瘤体重量，计算肿瘤生长抑制率。以每组小鼠的 平均瘤重作为疗效指标。肿瘤生长抑制率（％）＝ （１一治疗组平均瘤重／模型组平均瘤重）×１００％。 １．３．３相对肿瘤增殖率的计算裸鼠接种肿瘤细 胞后密切观察移植瘤生长情况及裸鼠的一般状况。 每隔１ｄ测量裸鼠体重及移植瘤的长径（ａ）、短径 （ｂ），按下列公式分别计算肿瘤体积（Ｖ）、相对肿瘤 体积（ＲＴＶ）和相对肿瘤增殖率（Ｔ／Ｃ），其中ｖ＝ａ ×ｂ ／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０为给药前肿瘤体积，ｖ为 ・９０６・ 安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２０１１ Ｓｅｐ；４６（９） 处死前肿瘤体积）；Ｔ／Ｃ（％）＝治疗组ＲＴＶ／模型组 ＲＴＶ Ｘ １００％。 性的细胞数／总计数的细胞数Ｘ １００％。 １．４统计学处理采用ＳＰＳＳ １６．０统计软件分析， １．３．４ ＣｏｎＡ诱导脾淋巴细胞增殖反应的测定 裸鼠处死后于超净台内无菌分离脾脏，在无菌平皿 数据以 ±ｓ表示，符合正态分布且方差齐性的资料 组间比较采用Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ检验，不符合者采 用秩和检验。 ２结果 中以２００目网用针芯研磨，移至离心管中，加入 ０．８４％的氯化铵溶液使红细胞裂解，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心１０ ｍｉｎ，洗涤细胞３次，台盼蓝染色计数活细胞 ９５％以上，用ＲＰＭＩ １６４０培养液制备脾细胞悬液（１ ２．１蜂毒素对人肝癌细胞裸鼠移植瘤体积的影响 ×１０ 个／ｍ１），在９６孔板上每孔加入１００ ｌ细胞液 （终浓度为５ Ｘ１０。个／ｍ１），１００ ｌ ＣｏｎＡ（５ ｍｇ／Ｌ）， 设５个复孔，于培养箱中培养４０ ｈ，终止培养前４ ｈ 弃上清液，每孔加入２Ｏ ｌ ５ ｍ ｍｌ ＭＴＴ和１８０ ｌ 裸鼠经过体内传代皮下接种细胞悬液后约１周， 皮下出现肉眼可见结节，１５ ｄ左右肿瘤直径０．３— ０．５ ＣＢ，成瘤率１００％。裸鼠肝癌皮下移植瘤呈结 无血清培养液，继续培养４ ｈ后，离心，弃上清，加 １５０ ｌ ＤＭＳＯ，５７０ ｎｍ处测吸光度（Ａ）值。 １．３．５ ＥＬＩＳＡ法检测裸鼠血清ＩＬ－１及ＴＮＦ－仅 经 节融合状，边界清楚。给药前各组移植瘤体积无明 显差异。给药过程中，蜂毒素各剂量组和阴性对照 组裸鼠肿瘤生长相对缓慢，模型组裸鼠移植瘤生长 迅速，个别裸鼠移植瘤出现破溃倾向。给药结束后 蜂毒素各剂量组和阳性对照组ＲＴＶ与模型组比较， 差异有显著性（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。蜂毒素腹腔给 药后可以明显减小移植瘤的体积，且具有剂量依赖 性，Ｔ／Ｃ逐渐减小。见表１。 ２．２蜂毒素对人肝癌细胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用 整个实验过程无裸鼠自然死亡，各组裸鼠行动自 如，进食饮水均正常，体重均有增加，各组问差异无 显著性。与模型组比较，蜂毒素各组瘤重明显减小 （Ｐ＜０．Ｏ１），蜂毒素中、高剂量组与阳性对照组比较 裸鼠眼眶静脉采血，室温放置３０ ｍｉｎ，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，吸上清，按照ＥＬＩＳＡ试剂盒的说明书进 行操作。 １．３．６荷瘤小鼠脾脏指数的测定脱臼处死裸鼠 后，剥离脾脏，称重后计算脾指数，脏器指数＝脏器 重量（ｍｇ）／动物体重（ｇ）。 １．３．７ ＴＵＮＥＬ法检测稞鼠移植瘤细胞凋亡 取 各组裸鼠石蜡包埋的移植瘤组织切片（４ ｍ）和多 聚赖氨酸包被的玻片，经常规裱片、烤片后，按 ＴＵＮＥＬ细胞凋亡原位检测试剂盒提供的实验步骤 进行操作。显微镜下观察并计数凋亡细胞数目，计 算凋亡指数（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ，ＡＩ），ＡＩ（％）＝凋亡阳 显著减小（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．Ｏ１），见表２。 ３蜂毒素对ＣｏｎＡ诱导的荷瘤小鼠脾淋巴细胞 增殖反应的影响与正常组比较，ＣｏｎＡ诱导的模型 表１蜂毒素对移植瘤体积的影响（ｎ＝６，ｘ±Ｓ） 与模型组比较： Ｐ＜Ｏ．０５，一Ｐ＜０．０１ 表２蜂毒素对荷瘤小鼠抑瘤率及脾指数的影响（ｎ＝６， ± ） 与模型组比较： Ｐ＜０．０５， Ｐ＜Ｏ．０１，与阳性对照组比较： Ｐ＜Ｏ．０５， Ｐ＜Ｏ・０１ ・９０８‘ 安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２０１１ Ｓｅｐ：４６（９） ｉｎ ｈｕｍａｎ ＭＧ６３ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｉｌｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２００７，８０ （４）：３６４—９． 作用¨ 。ＩＬ一１及ＴＮＦ—ｄ是重要的免疫炎症因子，两 者能相互增强活性，除可以直接杀伤肿瘤细胞外，还 通过细胞免疫机制发挥抗肿瘤作用＿１ 。本实验结 果表明蜂毒素可以提高荷瘤小鼠体内ＩＬ．１及ＴＮＦ． 的分泌水平，并且可以提高裸鼠的脾脏指数，提示 增强裸鼠的免疫功能可能是蜂毒素抑制肿瘤的机制 之一。 ［５］Ｌａｚａｒｅｖ Ｖ Ｎ，Ｐａｒｆｅｎｏｖａ Ｔ Ｍ，Ｇｕｌａｒｙａｎ Ｓ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌｉｔｔｉｎ，ａｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｍｙｃｏｐ ｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ ｉｎ ａ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａ ｇｅｎｔｓ，２００２，１９（２）：１３３—７． ［６］ 徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学［Ｍ］．北京：人民卫生 出版社，２００２：１７６２． 细胞凋亡是肿瘤生长的一个重要调节因素，肿 瘤不仅是细胞增殖和分化紊乱的疾病，也是凋亡异 ［７］ 赵斌，葛金芳，周明丰，等．喜树碱衍生物抗肿瘤活性的初步 筛选及部分作用机制［Ｊ］．安徽医科大学学报，２００７，４２（４）： ４２９—３２． 常疾病¨ 。本实验通过ＴＵＮＥＬ染色法直观的观察 到凋亡的细胞核呈棕黄色，模型组细胞凋亡数量少， ［８］ 张晨，凌昌全，李柏，等．蜂毒素对肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１ 增殖的影响［Ｊ］．中草药，２００３，３４（１）：４３—５． ［９］Ｓｅｋｉ Ｍ，Ｓａｋａｔａ Ｋ Ｍ，Ｏｏｍｉｚｕ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｌｅｃ． ｔｉｎ ９ ｏｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｓｙｎｏｖｉａｌ 提示蜂毒素可以诱导过度增殖的移植瘤细胞凋亡。 综上所述，蜂毒素可以显著抑制肝癌细胞 ＨｅｐＧ一２裸鼠皮下移植瘤的生长，提高机体的免疫水 平、促进癌细胞的凋亡可能是其抗肿瘤作用的机制 之一 ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００７，５６（１２）：３９６８—７６． ［１０］Ｓｏｎ Ｄ Ｊ，Ｌｅｅ Ｊ Ｗ，Ｌｅｅ Ｙ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ－ ｔｉ－ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ｐａｉｎ—ｒｅｌｅａｓｉｎｇ，ａｎｄ ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００７，１１５ （２）：２４６—７０． 参考文献 Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｍｕｒｒａｙ Ｔ，Ｗａｒｄ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ［Ｊ］．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ，２００５，５５（１）：１０—３Ｏ． ［１１］王怡苹，吕雄文，赵５０３—８． 斌，等．蜂毒素对胃癌细胞ＳＧＣ－７９０１细 胞增殖抑制作用及机制［Ｊ］．安徽医科大学学报，２０１０，４５（４）： ［２］ Ｂａｏ Ｓ Ｔ，Ｇｕｉ Ｓ Ｑ，Ｌｉｎ Ｍ Ｓ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｃ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏ— ［１２］司履生．肿瘤免疫研究的回顾与展望［Ｊ］．西安交通大学学报 （医学版），２００５，２６（２）：９７—１００． ｍａ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ Ｄｉｓ Ｉｎｔ，２００６，５（４）：５８０—３． ［３］ 陈永强，朱振安，郝永强，等，蜂毒素诱导骨肉瘤细胞Ｕ２ＯＳ凋 亡与坏死的实验研究［Ｊ］．中西医结合学报，２００４，２（３）：２０８ —［１３］Ｓｔｒｎｇｈａｎ Ｊ Ｍ，Ｏｌｉｖｅｒ Ｐ Ｇ，Ｚｈｏｕ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉ・ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＴＲＡ－８ ａｎｔｉ—ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５（ＤＲ５）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｃｏｍ— ｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａ ｃｅｒｖｉｃａｌ ９． ｃａｎｃｅｒｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２００６，１０１（１）：４６—５４． ［１４］杨全会，许荣．细胞凋亡与肿瘤［Ｊ］．生理科学进展，２００６，３７ （４）：３７３—８． ａ１．Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２－ｉｎｄｅ－ ［４］ Ｃｈｕ Ｓ Ｔ，Ｃｈｅｎｇ Ｈ Ｈ，Ｈｕａｎｇ Ｃ Ｊ，ｅｔｐｅｎｄｅｎｔ Ｃａ２ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｅｌｉｔｔｉｎ Ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｍｅｃｈａｍｓｍｓ ｏｆ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ Ｗａｎｇ Ｐｅｎｇｊｉｎｇ，Ｌｉ Ｊｕｎ，Ｈｕａｎｇ ｒａｎ，ｅｔ ａｌ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３２） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＨｅｐＧ一２ ｃｅｌｌｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｉｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ＨｅｐＧ－２ ｃｅｌｌ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｇｒｏｕｐ（１，２，４ ｍｇ／ ｋｇ），５－Ｆｕ ｇｒｏｕｐ（２ ｍｇ／ｋｇ），ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｆｏｒ １０ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｋｉｌｌｅｄ ２ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｉｅｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌｉｔｔｉｎ．Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ．１（ＩＬ １）ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ一 （ＴＮＦ一０【）ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅ— ｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）．Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＴＵＮＥＬ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｗｈｉｌｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ １，２ ａｎｄ ４ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ ｍｅｌｉｔｔｉｎ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｗｅｒｅ ４１．２％．６０．９％ａｎｄ ７１．０％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｓｍａ１１ｅｒ ｉｎ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｇｒｏｕｐｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０ １）．Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＬ一１ ａｎｄ ＴＮＦ。 ，ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｇｍｕｐｓ ｗｅＩ１ｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜Ｏ・Ｏ１） ・ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ 安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２０１１ Ｓｅｐ；４６（９） ・９０９・ 蜂毒素全氟碳纳米囊的制备及评价 代坤坤，李俊，赵斌，秦娣 摘要 目的制备蜂毒素全氟碳纳米囊，考察其外观特征、 统，并可诱导细胞凋亡，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗 粒径、Ｚｅｔａ电位、电镜形态、包封率及稳定性。方法以全氟 关节炎、抗肿瘤等广泛的生物学效应 。蜂毒素也 碳为纳米核心，通过高压均质法制备蜂毒素纳米囊。采用透 有明显的毒副作用，如溶血、致敏等，从而了其 射电镜和激光粒度分析仪检测纳米颗粒形态、粒径及Ｚｅｔａ 广泛应用。 电位，双波长考马斯亮蓝法测定纳米颗粒载药包封率。将制 备的蜂毒素全氟碳纳米囊乳液置于４℃下密封贮藏３０ ｄ，以 全氟碳的结构与碳氢化合物相似，但所有氢原 纳米囊的粒径和包封率的变化作为指标，考察其稳定性。结 子被氟原子替代，是一种超顺磁性材料。它无色无 果蜂毒素全氟碳纳米囊的平均粒径为８４．４１ ｎｍ，多分散 味，不导电也不助燃，具有一定的挥发性，化学性质 系数为０．１１５，Ｚｅｔａ电位为一５２．１ ｍＶ。采用双波长考马斯 稳定，体内代谢不会降解，无毒性。其很好的化学惰 亮蓝法测定蜂毒素全氟碳纳米囊包封率，在吸收度及线性均 性、较高的生物相容性和稳定性使之被用于人造血 良好的情况下，考马斯亮蓝法检测游离蜂毒素含量的检测范 液、呼吸窘迫时液态肺灌洗治疗和磁共振分子影像 围为０．５～２５ ｍｇ／Ｌ，该范围内线性良好，相关系数为０．９９９ 造影剂Ｅ５ ３。将蜂毒素包裹于纳米囊中，有利于减轻 ３，蜂毒素药物的包封率为（８６．３１±０．７６）％（ｎ＝３），ＲＳＤ＜ 药物不良反应，同时还能提高疗效。本研究拟采用 １％，稳定性良好。结论采用高压均质法制备蜂毒素全氟 全氟碳作为纳米颗粒核心，制备了蜂毒素纳米囊，并 碳纳米囊的方法可行，经粒径、形态、包封率方面的考察，结 对其粒径、Ｚｅｔａ电位、形态、包封率及稳定性进行了 果良好。 主题词蜂毒肽；纳米囊 评价。 自由词全氟碳；包封率；双波长考马斯亮蓝法 １材料与方法 中图分类号Ｒ ２８２．７４：Ｒ ２８３．６；Ｒ ４４６．９ 文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２０１１）０９—０９０９—０４ １．１药品与试剂全氟碳：百灵威科技有限公司； 蜂毒素：安徽百春制药有限公司；胆固醇、卵磷脂：美 蜂毒是工蜂遇攻击时通过螫针排出的毒汁，是 国Ｓｉｇｍａ公司；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ一６８：ＢＩＯ ＢＡＳＩＣ ＩＮＣ；三氯 具有高度生物学活性和药理学活性的复杂混合物， 甲烷：西陇化工股份有限公司；考马斯亮蓝Ｇ－２５０： 主要以肽类为主，其中蜂毒素约占蜂毒干重的 上海如吉生物科技发展有限公司。 ５０％，是蜂毒的主要成分，具有各种生物学活 １．２仪器ＮＳ１００１Ｌ２Ｋ高压均质机：意大利Ｎｉｒｏ 性 －３］，可以通过多种途径影响细胞的信号转导系 Ｓｏａｖｉ公司；ＲＶ１０ＤＳ２５旋转蒸发仪：德国ＩＫＡ集团； Ｂ２５实验室高剪切乳化机：上海贝尔特机电设备科 ２０１１—０３—３０接收 技有限公司；ＺＳ－９０纳米粒度仪：英国马尔文公司； 基金项目：国家自然科学基金（编号：３０９７３９１７）；安徽医科大学省部 ＪＥＭ－２１００Ｆ透射电子显微镜：日本电子株式会社 级重点实验室培育计划（编号：ＳＢＳＹＳ一０８０３） （ＪＥＯＬ）；ＤＬ一５０００Ｂ高速冷冻离心机：上海安亭科学 作者单位：安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级实验 室，合肥２３００３２ 仪器厂；ＯＤ１００Ｃ３３超滤管：美国Ｐａｌｌ公司；Ａｇｉ— 作者简介：代坤坤，男，硕士研究生； ｌｅｎｔ８４５０紫外扫描仪：美捷司；ＢＰ２１１Ｄ电 李俊，男，教授，博士生导师，责任作者，Ｅ．ｍａｉｌ：ｌｉｊｕｎ＠ 子天平：德国赛多利斯公司；ＲＯＩＳ５ ３０Ｌ超纯水机： ａｈｎｉｌ．ｅｄｕ．ＣＢ 美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＷＨ一３微型漩涡混合仪：上海沪 Ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ，ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． ＭｅＳＨ ｍｅｌｉｔｔｉｎ；ｌｉｖｅｒ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｒｅｅ ｗｏｒｄ ＨｅｐＧ－２
