旋毛虫3日龄成虫cDNA文库的免疫筛选

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旋毛虫3日龄成虫cDNA文库的免疫筛选

张亚兰1,付宝权1,2,刘明远13,原丽红1,吴秀萍1,李莲瑞1,卢　强1,陈启军3,P.Boireau2　(11解放军军需大学

　军事兽医系,吉林长春130062;21法国食品卫生安全局,巴黎94703;31瑞典微生物与肿瘤研究中心,斯德哥尔摩17177)摘要:以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行序列分析。结果从4×105个重组噬菌体中共获得33个阳性克隆。序列分析结果显示:共发现新cDNA序列16个,已知cDNA序列4个。其中阳性克隆Zh8,9,10,12,13,14,20,26,28,29,36,54,68,70编码丝氨酸蛋白酶。通过免疫学筛选直接获得了具有免疫反应原性的阳性cDNA克隆,为旋毛虫病诊断抗原及保护性抗原的筛选奠定了基础。关键词:旋毛虫;成虫;cDNA文库;免疫筛选

中图分类号:S852.731　　　文献标识码:A　　　文章编号:100524545(2004)0420355203　　旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinellaspiralis)引起的一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病,可感染人及150多种动物。旋毛虫抗原成分极其复杂,而且不能进行体外大量培养和繁殖,因此给旋毛虫病免疫诊断及预防带来困难。随着基因重组技术的发展和应用,通过构建旋毛虫cDNA表达文库,并对其进行免疫筛选以获得抗原基因已经有成功的报道[1～5]。旋毛虫肌幼虫,成虫和新生幼虫是3个主要的抗原期,由于肌幼虫是旋毛虫在宿主体内产生免疫逃避最长的时期,由这一时期获得的克隆表达抗原的特异性及保护性均不理想。新生幼虫期和成虫期是旋毛虫3个时期中的另2个侵袭期,而新生幼虫和成虫对机体的侵入需依靠一定的特有侵袭因子,而这些侵袭性因子极有可能就是新生幼虫和成虫与肌幼虫相比所特有的致病性因子和强保护性抗原。我室已分别构建了中国河南猪旋毛虫分离株3日龄成虫、5日龄成虫、新生幼虫、肌

[6,7]

幼虫cDNA文库,以及成虫和新生幼虫的扣除文库。本研究旨在从旋毛虫成虫时期入手,利用分子生物学及免疫学技术对旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫学筛选,分离成虫抗原基因,从而为旋毛虫病诊断抗原及保护性抗原的筛选及大量制备奠定基础。

114　猪抗旋毛虫血清的制备　随机取长白猪(20kg󰃗头)2

头,每头猪一次性经口感染旋毛虫肌幼虫1万条,感染后35d采血分离血清,用饱和硫酸铵沉淀法纯化,浓缩透析后获猪免疫血清IgG,用旋毛虫肌幼虫匀浆抗原通过免疫琼脂扩散法检测抗血清效价。

115　特异性抗体探针的处理　采用假筛选法[9]吸收纯化:将

大肠杆菌(E.coli)XL12Blue与非重组ΚZAP噬菌体铺板,42℃培养过夜以得到半融合裂解的菌苔,用经10mmol󰃗L

IPTG浸泡并晾干的硝酸纤维素滤膜铺于板上进行转膜,37℃培养10h左右,再将滤膜翻转铺于新培养的非重组Κ噬

菌体菌苔上,37℃继续培养10h左右。取下滤膜后浸于TNT(10mmol󰃗LTris2Cl(pH8.0),150mmol󰃗LNaCl,0.05%

Tween220)洗液中漂洗10min,将滤膜转移至含封闭剂(1%明胶和3%牛血清白蛋白)的TNT缓冲液中,室温封闭2h。

用封闭液对待吸附猪抗血清进行1∶10稀释,将滤膜与稀释后的待吸附猪抗血清共同温育6h,吸附后的猪抗血清中加入0.05的叠氮钠,于4℃保存备用。

116　旋毛虫成虫cDNA文库的免疫筛选及序列分析　筛选

1　材料与方法

111　旋毛虫虫种、cDNA文库和动物　中国河南猪旋毛虫分

方法参照文献[9],以1.2×104pfu󰃗150mm琼脂板铺板,

42℃倒置培养3.5h,转置37℃继续培养约6h再覆盖经10

mmol󰃗LIPTG预处理的硝酸纤维素膜,37℃继续培养16h,

离株,由本实验室提供,国际标准虫种编号为ISS534;中国河

南猪旋毛虫分离株3日龄成虫cDNA文库,由本室提供;普通长白猪,由本校实验动物中心提供。

112　宿主菌　辅助噬菌体ExassistTM、大肠杆菌(E.coli)

XL12Blue、XLOLR宿主菌,购自STRATAGENE公司。113　主要工具酶和试剂　EcoR󰂪、Xho󰂪、TaqDNA聚合

先将膜用TNT缓冲液漂洗,然后置于封闭液封闭1h,在1

∶200稀释的猪感染旋毛虫血清中孵育1h,洗涤后将膜放入用封闭液1∶4000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG中孵育1h,取出膜洗涤后,放入NBT󰃗BCIP底物中显色。根据膜上阳性环位置,挑取对应的噬菌斑,进行复筛以获得单克隆阳性噬菌斑。每次筛选均设有旋毛虫ES抗原阳性对照,非重组ΚZAP噬菌斑阴性对照及猪阴性血清对照。最后对单克隆阳性噬菌斑进行体外切割获得噬菌粒并转至宿主菌XLOLR,取单个菌落以T3及T7为引物做PCR鉴定其插入片段,进行序列测序,并与GenBank中已知序列进行同源性比较分析。

酶,购自TaKaRa公司;T3和T7引物均由TaKaRa公司合

成;EB、IPTG、BCIP、NBT等分子生物学试剂为Promega公司产品;Hybond2CExtra硝酸纤维素膜为Amersham公司产品;羊抗猪碱性磷酸酶标二抗为JacksonImmunoResearch公司产品。

　　收稿日期:2003212220

　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(NSFC30170709,

30328020);中法先进研究计划资助项目(PRABT03202)

2　结果

211　猪感染旋毛虫血清的制备及其吸附处理　猪感染旋毛

　　作者简介:张亚兰(19652),女,副教授,博士。　　3通讯作者,E2mail:liumy36@yahoo.com

虫血清免疫琼脂扩散试验结果表明,2头长白猪在人工感染

旋毛虫肌幼虫(10000条󰃗头)35d后用旋毛虫肌幼虫匀浆抗原测其抗体效价均可达到1∶16。从免疫筛选的非重组噬菌

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中国兽医学报　2004年7月　第24卷　第4期　ChinJVetSci　July2004　Vol.24　No.4

体阴性对照膜上可以看出:吸附后的猪抗旋毛虫血清与非重组噬菌斑未出现反应信号即成白色斑(图1),抗血清的吸附实验有效地去除了抗血清中非特异性抗体成份(主要包括抗噬菌体抗体和菌体裂解物抗体)。

212　阳性克隆的初筛与复筛　初筛共铺4.5×105个噬菌斑,筛选出疑似阳性克隆88个,经复筛后获33个阳性噬菌斑。阳性反应斑信号虽有强弱之分,但其信号较弱的与阴性斑相比仍有明显差异(图2)。213　阳性克隆的PCR鉴定、测序及序列分析　PCR初步鉴定阳性克隆,所有阳性克隆均扩增出外源DNA的条带。序列分析结果见表1。已知cDNA序列4个,Zh5,Zh87与TsSerPIN(AAF63473.1)同源;Zh66与TsORF9.10(AAB48491.1)同源;Zh40与TsSerineprotease(AAK16520.1)高度同源;Zh1与旋毛虫线粒体DNA(AF293969)高度同源。新cDNA序列16个,其中阳性克隆Zh8,Zh9,Zh10,Zh12,Zh13,Zh14,Zh20,Zh26,Zh28,Zh29,Zh36,Zh54,Zh68,Zh70中的外源基因cDNA序列分析表明,这14个阳性克隆呈现6种类型:(1)Zh68(1375bp),Zh8(1213bp),Zh54(1132bp);(2)Zh26(1165bp),Zh14(1087bp),Zh10(973bp);(3)Zh9(1514bp),Zh28(941bp),Zh29(941bp);(4)Zh36(1019bp),Zh20(1406bp),Zh13(987bp);(5)Zh12(976bp);(6)Zh70(1190bp)。其中(1),(2),(3),(4)序列同源性均为100%,只是大小有差异,分别是同一个mRNA分子的不同反转录产物。编码的蛋白序列与丝氨酸蛋图1　猪抗旋毛虫血清的吸附试验　白色斑点即阴性斑

白酶同源,可能形成一个新的丝氨酸蛋白酶家族,其中Zh68编码的开放阅读框架(ORF)最长。图2　阳性克隆复筛结果

表1　旋毛虫3日龄成虫cDNA文库免疫筛选阳性克隆分析

阳性克隆

Zh1Zh5,Zh87Zh66Zh40Zh8,Zh9Zh10,Zh12Zh13,Zh14,Zh20,Zh26,Zh28,Zh29,Zh36,Zh54,Zh68,Zh70Zh53Zh42Zh67Zh15Zh51Zh2Zh24Zh46Zh48Zh60Zh71Zh76Zh4Zh6221Zh6224

Ts53kDa,27%Paramyosin60%Porin30%

NosignificantsimilarityNosignificantsimilarityPDGFAprotein,29%Phosphoprotein,90%

Putativetransmembraneprotein,29%Tachykinninlikereceptor,43%60SribosomalProtein,30%Ran2bindingprotein,25%Ca2sensingreceptor,39%

Peptidyl2prolytis2transisomerase,46%Nucleolarprotein,25%T.phistoneH3.3,91%

Gprotein2coupledreceptorL7Ae,RPL8A

Asnrich,Lysrich,NLSBP7tM3,G2proteinreceptor

FKBP2typePeptidyl2prolyldomainGlnrichHistoneH3PP2AcMyosintailWAPLishGlurich

同源性检索

Tsmitochondrion(AF293969)

TsSerPIN(AAF63473.1)TsORF9.10(AAB48491.1)TsSerineprotease(AAK16520.1)TsSerineprotease

Trypsin

结构域

中国兽医学报　2004年7月　第24卷　第4期　ChinJVetSci　July2004　Vol.24　No.4

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3　讨论

　　随着现代分子生物学技术的发展,应用基因重组技术进行蛋白质编码基因的克隆与表达,使大量制备该寄生虫病的诊断抗原和疫苗抗原成为可能。构建于Κgtll及ΚZAP等表达载体的cDNA文库,采用免疫学方法钓取cDNA片段,从而分析抗原蛋白的抗原表位,选取最佳抗原,是研究旋毛虫疫苗的有效途径之一,根据不同的目的可以构建不同发育时期虫体的cDNA表达文库并应用不同时期的感染血清进行筛选。　　本试验所用的cDNA文库是利用ΚZAPExpress载体构建的中国猪旋毛虫分离株3日龄成虫cDNA文库,库容量为5×106,重组效率为98%以上,完全达到此标准。我们在构建了旋毛虫分离株3日龄成虫、5日龄成虫、新生幼虫、肌幼虫cDNA文库,以及成虫和新生幼虫的扣除文库后,先后克隆了旋毛虫新生幼虫期特异性基因[10,11]、成虫期特异性基因[12]和FYVE锌指结构蛋白基因[13]。由于动物血清中存在抗大肠杆菌和噬菌体蛋白的抗体,因此在利用抗体作为探针进行免疫筛选前,必须首先去除血清中的抗体成分,以消除非特异性反应。本研究在应用猪感染旋毛虫血清对旋毛虫成虫cDNA表达文库进行免疫筛选前,利用假筛选法对抗体探针进行了有效的吸附,确保了旋毛虫成虫cDNA文库免疫学筛选条件的优化。

　　关于旋毛虫成虫cDNA文库免疫筛选的报道很少,杨雅平等[1]用兔抗旋毛虫成虫可溶性抗原高免血清对我室构建的旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫筛选,从2×105个重组噬菌体中得到9个阳性克隆,用人工感染兔血清进一步复筛,鉴定出3个阳性克隆,并对阳性克隆Ts87进行了表达与分析,该重组蛋白可识别旋毛虫感染血清。我室用旋毛虫感染猪血清初筛获88个阳性克隆,经复筛后得到33个阳性克隆,但无此基因,说明免疫血清中的抗体与感染血清有差异。免疫筛选获得的阳性克隆中,有14个克隆6种类型的cDNA编码一个丝氨酸蛋白酶家族,崔晶等[14]发现旋毛虫河南株成囊前幼虫TspE1基因也有类似现象,具有基因多态性。丝氨酸蛋白酶在寄生虫与宿主的相互作用尤其是侵袭宿主以及免疫逃避有着重要的作用,存在于寄生蠕虫分泌物中的丝氨酸蛋白酶是其侵入宿主组织的重要因子之一。旋毛虫丝氨酸蛋白酶家族在其寄生中可能起着重要作用,有待于进一步研究。本试验通过该方法获得的旋毛虫成虫cDNA将为旋毛虫病的诊

断抗原基因及强保护性抗原(疫苗)基因的进一步深入研究奠定基础。参考文献:

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ImmunoscreeningofcDNALibraryofAdultTrichinellaspiralis

11,213111

ZHANGYa2lan,FUBao2quan,LIUMing2yuan,YUANLi2hong,WUXiu2ping,LILian2rui,

132

LUQiang,CHENQi2jun,P.Boireau　(1.FacultyofMilitaryVeterinary,QuartermasterUniversity　ofPLA,Changchun130062,China;2.UMRINRA2AFSSA2ENVA,Maison2Alfort,Paris,94703,　France;3.KarolinskaInstitute,StockhoIm,S217177,Sweden)

　　Abstract:cDNAlibraryof3daysoldadultofTrichinellaspiraliswasscreenedusingtheswineseraartificialinfectedwith

5

Trichinellaspiralisandthepositiveclonesweresequencedandanalysed.From4.5×10recombinant,33positivecloneswereobtained.Sequenceanalysisrevealed16newgenesand4knowngenes,positiveclonesZh8,9,10,12,13,14,20,26,28,29,36,54,68,70encodedserineprotease.ThiswilllaythefoundationtofurtherstudyontheTrichinellaspiralisantigen

.genes

　　Keywords:Trichinellaspiralis;adult;cDNAlibrary;immunoscreening　　3Correspondingauthor