铁皮石斛叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺及抗氧化活性

：／（）ＤＯＩ１０．３９６９ｉ．ｓｓｎ．１６７３－３８５１ｎ．２０１９．０３．０１６ｊ

铁皮石斛叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺及抗氧化活性

高海立，郁吉锋，黄路瑶，钱央央，徐　涛

）（浙江理工大学生命科学学院，杭州３１００１８

，Ｔ的ＤｉｃｉｎａｌＴｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｅａｆＦＤＬ）１０１型大孔吸附树Ｄｏｌ　　　　　　摘　要：研究铁皮石斛叶总黄酮（ｆｆ脂纯化工艺及其抗氧化活性。以动态吸附率、解吸率和总黄酮含量为指标，对影响大孔吸附树脂纯化效果的因素进）以抗坏血酸（采用１，行分析，确定最优的吸附－解吸附工艺条件；和乙二胺四乙酸（为阳性对照，Ｖ１ｃＥＤＴＡ）－二苯基－＋

）二铵盐阳离子自由基（法、法和菲洛嗪ＤＡＰＰＨ）２，２＇ＢＴＳ２３６－苦肼基自由基（－联氮－二（－乙基－苯并噻唑－－磺酸）

＋２＋

）（）法测定Ｔ总黄酮的螯合能力。结果表明：的抗氧化活性以及对金属离子（ｅｒｒｏｚｉｎｅＦＤＬ对ＤＰＰＨ和ＡＢＴＳｅＦＦ

、／，上样液ｐ上样液体积１洗脱液的最佳纯化工艺为上样液浓度２ＢＨ值２．２ｍｍＬ、６倍床体积（ｅｄｖｏｌｕｍｅＢＶ）．４、　ｇ

＋

，／；洗脱体积３总黄酮含量可达到１自室温，解吸率达到９在Ｄ０％乙醇、．２５ＢＶ（０．８３％）９３．９５ｍＰＰＨ和ＡＢＴＳ８ｇｇ２＋＋２＋

清除Ｄ的螯合３种抗氧化体系中，和Ｆ的半由基清除以及ＦｅＦＤＬ抗氧化活性具有浓度依赖性，ＰＰＨ、ＡＢＴＳｅＴ

／／其中对Ｄ即Ｔ分别为０数抑制浓度（Ｃ５．１１２３、０．７８４５ｍｍＬ和０．６４３４ｍｍＬ，ＰＰＨ的清除能力最强，ＦＤＬ具有Ｉｇｇ０）较强的提供氢原子的能力。Ｄ铁皮石斛叶总黄酮类化合物具有较强１０１大孔吸附树脂适用于对ＴＦＤＬ的分离纯化，的抗氧化活性，有进一步开发的价值。

纯化；抗氧化活性关键词：铁皮石斛叶；总黄酮；１０１大孔吸附树脂；Ｄ

）中图分类号：２８４．２６７３８５１（２０１９０５３８０７Ａ　　　　　　　文章编号：１Ｒ　　　　　　　　文献标志码：－３－０－０

Ｓｔｕｄｏｎｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｍａｃｒｏｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｔｉｏｎ　　　　　ｙｐｙｐｐ　　

ｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｆｆｉｃｉｎａｌｅａｆｒｅｓｉｎａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｏｆＤｏｌ　　　　　ｙ　

ＡＯ　ａｉｌｉ，Ｕ　ｉｅｎＡＮＧ　ｕａｏ，ＩＡＮ　ａｎａｎａｏＧＨＹＪＬＱＹＸＵ　Ｔｆｇ，ＨＵｙｇｙｇ，

，，Ｈ）（ｏｌｌｅｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＺｈｅｉａｎＳｃｉｅｃｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｎｚｈｏｕ３１００１８，ＣｈｉｎａＣ　　　　　－Ｔｇｊｇｙｇ　

：ＡｂｓｔｒａｃｔＩｔａｉｍｓｔｏｓｔｕｄｔｈｅｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｏｃｅｓｓｂＤ１０１ｍａｃｒｏｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔ　　　　　　　　　　ｙｐｐｙｐｙ　　ｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｅａｖｅｓ．ＡｎａｌｓｅｓｗｅｒｅｍａｄｅｏｎｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｔｈｅｉｃｉｎａｌｅｌＤｏ　　　　　　　　　　　ｙｇｆｆ　

，ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｃｒｏｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｔｉｏｎｒｅｓｉｎｆｒｏｍｔｈｅａｓｅｃｔｏｆｄｎａｍｉｃａｄｓｏｒｔｉｏｎｒａｔｉｏｄｅｓｏｒｔｉｏｎ　　　　　　　　　　　　ｐｐｐｐｙｐｐ，ｒａｔｉｏａｎｄｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔａｓｅｖａｌｕａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｏｔｉｍｕｍｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｓｏｒｔｉｏｎｄ　　　　　　　　　　　－ｐｐｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＴｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｏｆＴＦＤＬｔｏＤＰＰＨａｎｄＡＢＴＳ＋ａｎｄｉｔｓｃｈｅｌａｔｉｎａｂｉｌｉｔｔｏｍｅｔａｌ　　　　　　　　　　　ｐｙｇｙ　　　

２＋

）ｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｖｉａＤＰＰＨ，ＡＢＴＳ＋ａｎｄｆｅｒｒｏｚｉｎｅｍｅｔｈｏｄｓｗｉｔｈＶｃａｎｄＥＤＴＡａｓｏｓｉｔｉｖｅｉｏｎ（Ｆｅ　　　　　　　　　　　ｐ：ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｏｔｉｍａｌｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｒｅｌｏａｄｉｎｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　　　　　ｐｐｇ　

／，，ｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２．２ｍｍＬ，１６ｂｅｄｖｏｌｕｍｅ（ＢＶ）ａｅｃｎｄｏｆ２．４ｐＨｖａｌｕｅ８０％－ｔｈａｎｏｌｏｎｔａｉｎｅｄｅｌｕｅｎｔ　　　　－　　　　ｇ，，ｏｆｅｌｕｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｏｆ３．２５ＢＶ（ｄｅｓｏｒｔｉｏｎｒａｔｅｕｔｏ９０．８３％）ａｎｄｒｏｏｍｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｕｎｄｅｒｗｈｉｃｈｔｈｅ　　　　　　　　　　　ｐｐｐ　

／ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｃａｎｒｅａｃｈ１９３．９５ｍ．ＩｎｔｈｅｔｈｒｅｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｓｔｅｍｓｏｆＤＰＰＨａｎｄＡＢＴＳ＋　　　　　　　　　　　　　　ｇｇｙ

２＋

，，ａｄｉｃａｌｓｓｃａｖｅｎｉｎａｎｄＦｅｈｅｌａｔｉｎｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｏｆＴＦＤＬｄｅｅｎｄｓｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｈｅｈａｌｆｒｃ　　　　　　　　　ｇｇｇｙｐ　　

２＋

／／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ＩＣｏｒＤＰＰＨ，ＡＢＴＳ＋ａｎｄＦｅｃａｖｅｎｉｎｗｅｒｅ０．１１２３ｍｍＬ，０．７８４５ｍｓｆ　　　ｙｇｇｇｇ５０）　　

／；，ｍＬａｎｄ０．６４３４ｍｍＬｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌｔｈｅＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｉｎｃａａｃｉｔｗａｓｓｔｒｏｎｅｓｔｎａｍｅｌＴＦＤＬ　　　　　　　ｇｐｙｇｇｐｙｇｙ　　　

收稿日期：２２０１８－１２－１３　　网络出版日期：０１９－０３－０５

，高海立（硕士研究生，主要从事天然药用植物资源开发方面的研究。作者简介：男，山东菏泽人，１９９１－　）：通信作者：徐　涛，ａｉｌｘｕｔａｏ１９９８ｃｎ６３．ｃｏｍＥ－ｍ＠１

第３期

高海立等：铁皮石斛叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺及抗氧化活性

３８１

ａｓａｓｔｒｏｎａｂｉｌｉｔｔｏｒｏｖｉｄｅｈｄｒｏｅｎａｔｏｍｓ．Ｄ１０１ｍａｃｒｏｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｔｉｏｎｒｅｓｉｎｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｈ　　　　　　　　　　ｇｙｐｙｇｐｐ　　

ｓｅａｒａｔｉｏｎａｎｄｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴＦＤＬ，ａｎｄｔｈｅｃｏｍｏｕｎｄｓｏｆＴＦＤＬａｒｅｏｆｓｔｒｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔ．Ｉｔｉｓ　　　　　　　　　　　　　ｐｐｐｇｙ　ｗｏｒｔｈｆｕｒｔｈｅｒｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ．　　ｐ

：Ｄ；；Ｄ；ｐ；Ｋｅｗｏｒｄｓｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｅａｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ１０１ｍａｃｒｏｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｃｉｎａｌｅｌｏ　　　ｐｆｆｙ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ

０　引　言

铁皮石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔＭｉｇｏ），属多年生草本植物，传统名贵中药材，常取茎部入药；迄今为止，有关石斛茎成分分析和药理药

效研究已有大量报道［１－２］，但对其他部位的药用成分

研究仍有不足。铁皮石斛叶属于非药用部位，在石斛植株中占很大比例，其中黄酮类化合物为其主要

有效成分［

３］

。黄酮类化合物一种普遍存在于高等植物中的次生代谢产物，具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗感染和抗病毒等，保护身体免受由氧

化应激所诱发的诸多慢性病的侵害［

４－７］。黄酮类化合物的纯化方法主要有大孔吸附树脂、硅胶柱、聚酰胺、葡聚糖凝胶和高速逆流色谱

等［

８－９］。其中大孔吸附树脂利用其多孔结构和选择性吸附功能从天然药物中分离纯化有效成分，具有花费少、纯化效率高、溶剂用量少、易再生等优点，目前已经广泛应用于中药成分研究

［９－１１］。不同的树

脂由于其极性、粒径、表面积范德华力和氢键相互作

用等物理特性的差异，可以用来富集不同的成分［

８］

。另外，

大孔吸附树脂主要以乙醇－水体系用作洗脱溶剂来解吸目标化合物，

无论是对纯化目标产物还是环境都是安全友好的［

１２］

。本文选用Ｄ１０１大孔吸附树脂对铁皮石斛总黄酮进行分离纯化，通过ＤＰＰＨ法、ＡＢＴＳ＋法和Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ法对ＴＦＤＬ类化合物进行抗氧化活性评

价，探讨其对ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ＋、Ｆｅ２＋

的清除能力，为铁皮石斛叶的深度开发奠定基础。

１　材料与方法

１

．１　实验材料铁皮石斛叶干品，由浙江省湖州市德清牧歌石斛有限公司提供，经粉碎机粉碎，过６０目筛，备用。Ｄ１０１型大孔吸附树脂（Ｃａｔ＃Ｍ００４１），购于北京索莱宝科技有限公司。

１．２　实验主要仪器与试剂

ＫＱ－２５０ＤＥ型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；７２１紫外－可见分光光度仪（

上海菁华科技仪器有限公司）；纯水仪Ｈｅａｌ　

ＦｏｒｃｅＮＷ１５ＵＶ（上海康雷分析仪器有限公司）；真空干燥箱（宁波扬辉仪器有限公司）；旋转式蒸发器ＲＥ－５２Ａ型（上海亚容生化仪器厂）；ＤＵ８００型紫外－可见

分光光度计（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳＡ）；普通层析柱（１６×００ｍｍ，Ｓａｎｇ

ｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）。芦丁标准品（产品编号：ＳＲ８２５０，北京索莱宝科技有限公司）；木瓜蛋白酶（２０００Ｕ／ｍｇ，Ｓａｎｇ

ｏｎＢｉｏｔｅｃｈ）；纤维素酶（１１０Ｕ／ｍｇ，ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ

ｏｒａｔｉｏｎ）；ＤＰＰＨ（阿拉丁生化科技股份有限公司）；ＡＢＴＳ（北京索莱宝科技有限公司）；菲洛嗪（Ｓａｎｇｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）。试剂均为分析纯。．３　芦丁标准曲线绘制参照Ｊｉａ等［１３］

的方法并稍加改进。称取１０ｍｇ芦丁标准品，用８０％乙醇溶液溶解并定容至

０ｍＬ，配成浓度为０．２ｍｇ／ｍＬ的标准液。分别取芦丁标准液０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍＬ和

．０ｍＬ，加水至１０ｍＬ；分别加入１．５ｍＬ亚硝酸钠（５％），充分摇匀，静置６ｍｉｎ，加入１．５ｍＬ硝酸铝

（１０％），充分摇匀，静置６ｍｉｎ；最后加入４ｍＬ氢氧化钠（４％），摇匀，并放置２０ｍｉｎ。在５１０ｎｍ波长处测定吸光度，以吸光度（Ａ）为纵坐标，芦丁质量浓度（Ｃ）为横坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为＝６．９１５５ｘ－０．０１２３，Ｒ＝０．９９８８。．４　ＴＦＤＬ干浸膏制备及总黄酮含量测定

由实验室前期工作得到ＴＦＤＬ粗提液的最优化提取工艺：液料比３０∶１，乙醇浓度４５％，ｐＨ值６，酶解温度５５℃，酶解时间６０ｍｉｎ，复合酶比（纤维素酶∶木瓜蛋白酶）１．５∶１．０，加酶量１．０％，

超声处理时间１０ｍｉｎ，超声功率１００ｗ。按标准曲线测定方法确定ＴＦＤＬ的提取率为１．８１％。将粗提液℃静置过夜，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩（－０．１ＭＰａ，８０℃），再真空干燥箱（－０．１ＭＰａ，６０℃）

干燥至恒重，得干浸膏，４℃储存备用。．５　大孔吸附树脂的动态吸附－解吸附．５．１　大孔吸附树脂预处理

大孔吸附树脂预处理的方法参考文献［１４－１５］，具体方法如下：取Ｄ１０１大孔吸附树脂用９５％乙醇浸泡

２１５６ｙ１４１１３８２

自然科学版）　　　　　　　　浙　江　理　工　大　学　学　报（２０１９年　第４１卷

，湿法装柱，以９收集流出液，测４ｈ５％乙醇连续冲柱，２

定在２直到与９５４ｎｍ处吸光度，５％乙醇吸光度值一致时，表明树脂处理干净，水洗至无醇味，备用。

１．５．２　影响大孔吸附树脂纯化效果的单因素分析

准确量取湿树脂２按１０ｍＬ，．５．１方法预处理。精确称取铁皮石斛叶总黄酮干浸膏０．５ｇ进行过柱纯／，化，固定过柱条件为上样速率４Ｂ水洗脱速率Ｖｈ

／，／，水洗脱体积３Ｂ乙醇洗脱速率１Ｂ其ＶｈＶ，Ｖｈ４Ｂ

（／／它过柱条件见表１１ｍｏｌＬ　ＨＣｌ和１ｍｏｌＬＮａＯＨ。以树脂吸附率和吸附量为指标，调节ｐ探究Ｈ值）不同上样液浓度（系列一）和不同ｐ系列二）对Ｈ值（纯化效果的影响；以解吸率和纯化样品中总黄酮含量为指标，探究不同乙醇体积分数（系列三）对纯化效果的影响。

因子

表１　影响大孔树脂纯化效果的单因素分析

实验系列系列一系列二

（·上样液浓度／ｍｍＬ－１）ｇ．６、１．０、１．４、１．８、２．２、２．６０　

２．２　．２２　

Ｈ值ｐ乙醇体积分数／％

７０

７０

４０、５０、６０、７０、８０、９０

３．６　

１．８、２．４、３．０、３．６、４．８、６．０　

２．４　

系列三

　　上述所涉计算公式：

／％＝（／００ＥＣ０－Ｃ１）Ｃ０×１

／ｅ＝（ＱＣ０－Ｃ１）Ｖ１Ｍ（／Ｄ／％＝Ｃ２Ｖ２Ｃ０－Ｃ１）Ｖ１×１００

／％＝Ｃ２／００ＣＶ２Ｍｐ×１

（）１

（）２（）３（）４

／，扫描间隔用无水甲醇为参比液，扫描速度４０ｎｍｍｉｎ２

０．２ｎｍ。１．７　体外抗氧化活性测定１．７．１　ＤＰＰＨ自由基清除

，具体ＤＰＰＨ自由基清除方法参考文献［１６７］１－为：称取铁皮石斛叶总黄酮干浸膏和纯化后样品，分别用水配成不同浓度的样品溶液（５０、１００、３００、５００、／／。取１１０００μｍＬ和１５００μｍＬ）．５ｍＬ不同浓度ｇｇ

／的样品溶液，加入１．５ｍＬ０．２５ｍｍｏｌＬＤＰＰＨ溶　　，液，摇匀，室温下避光反应３０ｍｉｎ５１７ｎｍ处测定。以１吸光度，记为Ａ１（样品组吸光度）．５ｍＬ无水乙醇和１样品记为Ａ２（．５ｍＬ样品溶液测吸光度，。以１／对照组吸光度）．５ｍＬ的０．２５ｍｍｏｌＬ

空记为Ａ０（ＤＰＰＨ溶液和１．５ｍＬ水为空白对照，。Ｖ白对照吸光度）ｃ作阳性对照。计算各浓度的清除率及ＩＣ５ＰＰＨ自由基清除率由（１－０值。Ｄ（／００％计算得出。Ａ１－Ａ２）Ａ０×１

＋

自由基清除１．７．２　ＡＢＴＳ＋

，具体自由基清除方法参考文献［ＡＢＴＳ１８］

／；其中：ｅ为吸附量，％；ｍＥ为吸附率，ＱＤ为解吸ｇｇ／；率，％；ｍＣ为纯化后总黄酮含量，Ｃ０为上样液黄ｇｇ／／酮含量，ｍｍＬ；Ｌ；ｍｍＣ１为过柱后黄酮含量，Ｖ１ｇｇ

为上样液体积，烘Ｍ为大孔吸附树脂质量（ｍＬ；

，；／干）Ｃ２为洗脱液黄酮含量，Ｖ２为洗脱ｍｍＬ；ｇｇ液黄酮体积，Ｌ；ｍＭｐ为纯化后得到的总黄酮质。量，ｇ１．５．３　动态泄露曲线考察

，称取铁皮石斛叶总黄酮干浸膏１用水配制．５ｇ／／成２用１ｍ．２ｍｍＬ的上样液，ｏｌＬ　ＨＣｌ调至ｐＨｇ

值为２按１每间隔．４，．５．２所得条件过柱处理，，测定每管中流出约４ｍＬ）２０ｍｉｎ收集一管流出液（

（／液总黄酮浓度，以上样时间为横坐标，为纵Ｃ１Ｃ０）坐标绘制动态泄露曲线。

１．５．４　动态洗脱曲线考察

，称取铁皮石斛叶总黄酮干浸膏０配制成．７ｇ／／用１ｍ２．２ｍｍＬ的上样液，ｏｌＬ　ＨＣｌ调至ｐＨ值ｇ

为２按１用８．４，．５．２所得条件过柱处理，０％乙醇洗脱，每５ｍＬ收集一管，测定每管中洗脱液总黄酮浓度，以洗脱液体积为横坐标，洗脱液中ＴＦＤＬ浓度为纵坐标绘制动态洗脱曲线。

１．６　紫外吸收光谱测试

称取铁皮石斛叶总黄酮干浸膏和最优工艺得到的／叶总黄酮样品，分别用无水甲醇配制成０．２ｍｍＬ和ｇ／０．１ｍｍＬ溶液。采用ＤＵ００型紫外分光光度计检８－ｇ

测Ｔ选ＦＤＬ在２００００ｎｍ范围内的吸收光谱变化，～６

方法为：分别取０．１ｍＬ不同浓度（１００、３００、６００、

／／的黄酮干浸膏１２００、１８００μｍＬ和２４００μｍＬ）ｇｇ样品溶液和纯化后样品溶液，加入３．９ｍＬ

＋

，溶液，在摇匀，室温下避光反应７ｍＡＢＴＳｉｎ。记为Ａｉ（样品组吸光度）７３４ｎｍ处测定吸光度，

＋

以３溶液测．９ｍＬ无水乙醇代替３．９ｍＬＡＢＴＳ　

。以０吸光度，记作Ａｊ（样品对照组吸光度）．１ｍＬ记为Ａｋ水代替０．１ｍＬ样品溶液作为空白对照，

（。Ｖ空白对照吸光度）ｃ作阳性对照。计算各浓度

＋＋样品溶液的Ａ清除率及Ｉ自ＢＴＳＣ５ＢＴＳ０值。Ａ

／由基清除率由（１－（００％计算Ａｉ－Ａｊ）Ａｋ×１

得出。

第３期

高海立等：铁皮石斛叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺及抗氧化活性

３８３

１

．７．３　Ｆｅ２＋

螯合能力测定Ｆｅ２＋

螯合能力测定参考文献［１９－２０］，具体方法为：试管中分别加入１ｍＬ不同浓度（１００、２００、４００、８００、１２００μｇ／ｍＬ和１６００μｇ

／ｍＬ）的黄酮干浸膏样品溶液和纯化后样品溶液，３．７ｍＬ水，０．１ｍＬ　２ｍｍｏｌ／Ｌ的ＦｅＣｌ２溶液，

混和均匀，５ｍｉｎ后加入０．２ｍＬ　５ｍｍｏｌ／Ｌ的菲洛嗪溶液，室温放置１０ｍｉｎ后，于５６２ｎｍ处测定吸收值，记为Ａｍ（样品组吸光度）。以１ｍＬ样品溶液和４．０ｍＬ水测吸光度，记为Ａｎ（样品对照组吸光度）。以１ｍＬ水代替样品溶液作为空白对照，记为Ａｌ（空白对照吸光度）。以ＥＤＴＡ作阳性对照。计算各浓度的

清除率及ＩＣ５０值。Ｆ

ｅ２＋

螯合能力由（１－Ａｍ－Ａｎ）／Ａｔ×１００％计算得出。

１．８　数据分析

本文所得数据统计分析和单因素ＡＮＯＶＮ分析（显著性分析Ｐ≤０．０５）均由Ｅｘｃｅｌ　２０１０和ＩＢＭ　ＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ　２２完成，绘图由Ｏｒｉｇ

ｉｎＰｒｏ９．０完成。２　结果与分析

２．１　单因素考察结果分析图１是不同因素对Ｄ１０１大孔吸附树脂纯化效果的影响。图１（ａ）为上样液浓度对总黄酮吸附率和吸附量的影响，在０．６～２．２ｍｇ／ｍＬ范围内，树脂吸附率和吸附量随上样液浓度增加而增大，２．２ｍｇ／ｍＬ达到最大值，分别为６０．７１％和６．３７ｍｇ／ｇ；上样液浓度１．８ｍｇ／ｍＬ和２．２ｍｇ／ｍＬ的吸附率和吸附量差异不显著；上样液浓度２．６ｍｇ

／ｍＬ时，吸附率和吸附量值骤降，其原因可能是上样液浓度太高没有完全溶解，堵塞树脂，或泄露点出现太早，造成黄酮类成分损失，因此上样液浓度范围为１．８～２．２ｍｇ／ｍＬ。图１（ｂ）为上样液ｐＨ对总黄酮吸附率和吸附量的影响，在酸性条件下大孔吸附树脂对铁皮石斛叶总黄酮类化合物的更好的吸附性能，随着ｐＨ值（２．４～６．０）增加，树脂吸附率和吸附量逐渐减小；当ｐＨ值为１．８时，上样液中有沉淀析出，可能为黄酮苷类成分形成的，故最合适的ｐ

Ｈ值为２．４。图１（ｃ）为乙醇浓度对大孔吸附树脂解吸率和纯化样品中总黄酮含量的影响，在乙醇浓度为４０％～８０％时，树脂的解吸率和纯化样品中黄酮类化合物含量迅速增大。进一步增加乙醇浓度，树脂的解吸率和纯化样品中黄酮类化合物含量不升反降。８０％乙醇为最佳洗脱浓度，本文选择８０％乙醇作为洗脱剂。

图１　不同因素对Ｄ１０１大孔吸附树脂纯化效果的影响

．２　动态泄露曲线为了明确Ｄ１０１大孔吸附树脂吸附状态，确定上样液体积，对其动态吸附过程进行测定，结果如图所示。图２表明，１６０ｍｉｎ之前有少部分黄酮类成分流出并缓慢增加，其原因可能是少量极性较大的黄酮类成分不能被非极性的Ｄ１０１大孔吸附树脂所吸附。１６０～２８０ｍｉｎ为树脂吸附的稳定期，２８０ｍｉｎ之后，黄酮类成分的泄露量迅速增加，２８０ｍｉｎ树脂达到饱和吸附状态。故可以确定上样液体积为１６倍床体积。

２

２４３８

自然科学版）　　　　　　　　浙　江　理　工　大　学　学　报（２０１９年　第４１卷

图２　ＴＦＤＬ的动态泄露曲线

．３　动态解吸附曲线图３为ＴＦＤＬ的动态解吸附曲线，图３表明：洗脱液中总黄酮含量随着乙醇溶液体积的增加，呈现先增加后减少的趋势。洗脱液中总黄酮含量达到最大值，所需洗脱液体积为２０ｍＬ；随着洗脱液体积增加，洗脱液中总黄酮含量迅速降低。洗脱液体积．２５ＢＶ时，解吸率达到９０．８３％；５ＢＶ时，解吸率达到９６．１５％。将大部分铁皮石斛叶黄酮类成分从树脂上洗脱下来，至少需要８０％乙醇３．２５ＢＶ，因此，采用３．２５ＢＶ的８０％乙醇进行洗脱。

图３　ＴＦＤＬ的动态解吸附曲线

．４　紫外吸收光谱图图４为ＴＦＤＬ的紫外吸收光谱图，由图４可知，ＴＦＤＬ在２２０～２８０ｎｍ和３００～４００ｎｍ两个波长范围内，有两个特征峰存在，证明提取和纯化的样品确实为黄酮类成分，且纯化后的ＴＦＤＬ紫外吸光度显著高于纯化前，特征峰更明显，表明纯化过程明显提高目标产物的纯度。

．５　抗氧化活性分析

图５是不同浓度铁皮石斛叶干浸膏和叶纯化样品黄酮溶液的抗氧化能力。由图５（ａ）显示，铁皮石斛叶总黄酮对ＤＰＰＨ的清除能力随着浓度升高迅速增加，表现出较强的浓度依赖性。纯化前后铁皮石斛叶总黄酮的半数抑制浓度（ＩＣ５０）

分别是４５．３０μｇ／ｍＬ和１１２．２８μｇ

／ｍＬ，经过初步纯化后图４　ＴＦＤＬ的紫外吸收光谱

图５　不同浓度铁皮石斛叶干浸膏和叶纯化样品

黄酮溶液的抗氧化能力

２

３　２

２２第３期

高海立等：铁皮石斛叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺及抗氧化活性

３８５

的叶黄酮样品对ＤＰＰＨ清除能力明显提高。在

１５００μｇ／ｍＬ时，纯化后样品的清除率达到９５．２８％，表明叶黄酮样品对ＤＰＰＨ具有较强的清

除能力。在图５（ｂ）中，５０～１８００μｇ／ｍＬ范围内，ＴＦＤＬ对ＡＢＴＳ＋的清除能力随着浓度的增加而逐

渐增大。在浓度为１８００μｇ／ｍＬ时，铁皮石斛叶粗提液对ＡＢＴＳ＋的清除率达到９１．５１％，而纯化后样品的清除能力却略有降低。结合图２动态泄露曲线，从上样开始就有少部分极性较大的黄酮类成分流出树脂，故分析可能是由于这部分黄酮类成分的损失造成的，但具体的原因还有待进一步实验验证。纯化前后ＴＦＤＬ的ＩＣ５０分别是６

５３．０８μｇ／ｍＬ和７８４．４９μｇ

／ｍＬ。图５（ｃ）显示，在测定范围内（１００～１６００μｇ

／ｍＬ），ＴＦＤＬ对Ｆｅ２＋螯合能力随着浓度的增大而逐渐增大，ＴＦＤＬ纯化前后ＩＣ５０值分别为

１１０６．３３μｇ／ｍＬ和６４３．４０μｇ

／ｍＬ。纯化前后ＴＦＤＬ对Ｆｅ２＋

离子的最大螯合能力分别达到６５．１１％和６４．９２％，

差异不明显，因此纯化前后黄酮类成分变化不明显，纯化明显提高产品纯度。

３　讨　论

大孔吸附树脂是一种表面活性吸附剂，通过物理吸附从中草药及其制剂提取物的水溶液中有选择性地吸附其中的有效成分，去除无效成分的一种分

离纯化工艺，可以达到分离、富集的目的［１４］

。Ｚｈａｎｇ等［２１］

利用Ｄ１０１大孔吸附树脂纯化鱼腥草黄酮类化

合物，在最佳纯化条件下，黄酮类化合物的含量可达

６０％以上，总收率达９３．３％。李腾等［２２］

对Ｄ１０１大

孔吸附树脂分离纯化栀子大黄汤有效部位群条件进行研究，发现依次运用３０％乙醇、６０％乙醇、７０％乙醇可以将总环烯醚萜苷、总黄酮、总异黄酮和总蒽醌

分别洗脱完全。汤如莹等［１５］

采用正交设计法优选

Ｄ１０１大孔吸附树脂分离纯化沙苑子总黄酮的工艺，采用优选工艺得到的沙苑子总黄酮含量为５６．２４％，工艺转移率为６８．３７％。本文研究Ｄ１０１

大孔吸附树脂分离纯化ＴＦＤＬ工艺，采用最佳工艺，得到树脂对ＴＦＤＬ的吸附率为８１．６４％，解吸率为６８．６７％。通过纯化去除了其中大量水溶性非目标成分，如糖类、蛋白质、鞣质等，使得到的黄酮类化合物样品颜色鲜亮，改变黑、大、粗的现象。实验结果表明，Ｄ１０１大孔吸附树脂适用于对铁皮石斛叶黄酮类化合物的分离纯化，效率高，操作简单，绿色环保。大孔吸附树脂分离纯化效果受多种因素的影响，主要包括树脂本身结构、被吸附化合物结构、上

样液浓度、上样流速、洗脱液、洗脱液的流速、ｐ

Ｈ、温度等［

２３］

。上样液浓度是影响大孔吸附树脂纯化效果的重要因素，当上样液浓度过低时过柱时间增加，工作效率降低；当上样液浓度过高时泄露点出现早，目标成分损失严重，树脂利用率低。当上样液浓度在１．８～２．２ｍｇ／ｍＬ范围内，吸附率和吸附量均达到最大值，且差异不明显。为了使树脂得到最大限度的利用，本文选择２．２ｍｇ／ｍＬ进行上样。上样液的ｐＨ值影响溶质的电离程度，

是影响大孔吸附树脂吸附量的关键参数［２４］

。当ｐＨ值较高时，黄酮酚羟基分离Ｈ＋，氢键相互作用减少，从而导致较低

的吸附能力［９］

。本文结果表明，随ｐＨ值（２．４～．０）的升高，树脂的纯化效果逐渐减弱，ｐ

Ｈ值为．４时，纯化效果最好。从安全和环保角度考虑，本文选择一定浓度乙醇作为洗脱剂。图１（ａ）—（ｂ）和图２显示Ｄ１０１大孔吸附树脂进行叶黄酮的分离纯化过程中，吸附率略低，有少部分极性较大的黄酮类成分损失，故可以尝试用弱极性大孔吸附树脂进一步提高其吸附率。

大多数黄酮类化合物分子中具有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，因此其甲醇溶液在００～４

００ｎｍ波长范围内，会出现两个紫外吸收带，峰带Ｉ（３００～４００ｎｍ）及峰带ＩＩ（２２０～２８０ｎｍ）

［２

５］。纯化前后ＴＦＤＬ样品经ＤＵ－８００型紫外分光光度计００～４００ｎｍ波长范围内扫描验证，

出现两个显著的特征峰，进一步说明大孔吸附树脂纯化效果显著。在植物体内存在很多天然的抗氧化剂，例如黄酮类、

酚酸类、多糖、鞣质类等［

２６］

。其中黄酮类化合物通过提供氢原子或电子来清除自由基，自身被转化为苯氧基。本文所获得的ＴＦＤＬ纯化样品在ＤＰＰＨ

清除和Ｆｅ２＋

螯合能力上得到明显提高，对ＤＰＰＨ、

ＡＢＴＳ＋、Ｆｅ２＋

的半数抑制浓度（ＩＣ５０）分别为１２．２８、７８４．４９μｇ／ｍＬ和６４３．４０μｇ

／ｍＬ。　结　论

本文通过对Ｄ１０１型大孔吸附树脂法在不同因素影响下对ＴＦＤＬ纯化效果及ＴＦＤＬ的抗氧化活性分析，得到以下结论：

ａ）在上样液浓度为２．２ｍｇ

／ｍＬ，上样液ｐＨ值为．４，上样量为１６ＢＶ，洗脱乙醇浓度为８０％条件下，

最终得到的样品中总黄酮含量达到１９３．９５ｍｇ／ｇ，是粗提液中总黄酮含量的１０．７２倍，纯化效果明显。这说明Ｄ１０１大孔吸附树脂适用于ＴＦＤＬ的分离纯化。

ｂ）ＴＦＤＬ具有良好的抗氧化能力，

且呈浓度依６２２２１４２３８６

自然科学版）　　　　　　　　浙　江　理　工　大　学　学　报（２０１９年　第４１卷

赖性关系。Ｄ１０１大孔吸附树脂的纯化进一步提高

了其在ＤＰＰＨ清除和Ｆｅ

２＋螯合上的能力，其中对ＤＰＰＨ自由基的清除能力最强。ＴＦＤＬ有望开发成

一种天然抗氧化剂。参考文献：

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