风湿病与关节炎２０１３年第２卷第１１期Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ２０１ ３，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．１ １ ・３５・ 基础研究・ 透骨消痛胶囊对兔膝骨关节炎模型血清 与关节液炎症因子的影响 肖晓金 ，包侠萍！，陈文列 ，陈赛楠 ，刘献祥 ，李孝栋 【摘要】目的：观察透骨消痛胶囊卜预新 兔膝骨火节炎的效果，探讨其治疗坩火节炎的抗炎作 川机制。方法：选取７２只健康新两兰兔，随机分为卒 对照绢，模型刈 照组，盐酸氦基葡萄糖胶瞧组以 及透坩消痛胶瞧低、巾、高剂量组共６细，每组ｌ２只。除宅 对照细外， 他５绀均造成 膝 ＦＬ，１］ 火 炎 的帧 造模后，透骨消痛胶囊低、【１１、高剂量绀每天给 约物灌肖治疗，模 ，Ｘ…，＋Ｅ…ｌ￣＠…ＰＩ空ｒｌ埘照 灌Ｗ 给 纯化水，盐酸氦基葡萄糖胶睫组给了盐酸氮基葡萄糖胶瞧灌胃治疗。给药后第４周干¨第８剧分圳抽取 符 ｆｌ兔的 液和Ｊ膝火节液，采ＨＪ酶职免疫吸附法（ＥＬｌＳＡ法）测定新两≥兔ｍ清和骨火节液的 细胞介 索一１１３、肿瘤 死ｌ大ｌ子一０【、堪质金属蛋 嗨一３、透明质峻的农达水平并进行比较。结果：透骨消痛胶睫埘 新 兔 清干【ｌ愫父 骨火节液ｒｆｔ的白细胞介素一ｌＢ、肿瘤坏死 子一【Ｉ币『】基质金属赁广１临一３具有较强的 Ｉ 坝作川，透骨消埔胶炭离刹 组比模 对照组 著降低；各给药细关节液厂ｒ『透明质酸的表达Ｌｊ模 对照 组比较，蓐异儿统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论：透骨消痫胶瞧 有治疗 ｝ｊ 关 炎＿币【１减轻炎症的作ＪｔＪ，件 川机制 Ｊ－ｊｑ１￣，，ｌ Ｊｉｌｌ 及天 液ｔＩＩ 细胞介素一１１３、Ｈ中瘤坏＿步匕 子一【Ｉ和Ｉ基质金属生 嗨一３的表达仃火 【关键词】 Ｈ 关 炎；透侣 消痛胶囊；血清；关节液；炎症ｌ 子；兔 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｏｕｇｕ Ｘｉａｏｔｏｎｇ Ｃａｐｓｕｌｅ ｏｎ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｓｙｎｏｖｉａ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔ Ｍｏｄｅｌｓ ｗｉｔｈ Ｋｎｅｅ ０ｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＸｉａｏＸｉａｏ－ｊｉｎ，Ｂａｏ Ｘｉａ－ｐｉｎｇ，Ｃｈｅｎ Ｗｅｎ－ｌｉｅ，Ｃｈｅｎ ＳａＬｎａｎ，Ｌｉｕ Ｘｉａｎ－ｘｉａｎｇ，ＬｉＸｉａｏ—ｄｏｎｇ 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｂｙ ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ ｉｔｓ ｅｆｌ＇ｅｃｔｓ ｏｎ ｋｎｅｅ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：７２ ｈｅａｌｔｈｙ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｎｄ ｅｑｕａｌｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃａｐｓｕｌｅｓ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗ，ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ．Ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ５ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｉｇｈｔ ｋｎｅｅ ｏｓｔｅｏａｌ。ｔｈｒｉｔｓｆ ｍｏｄｅｌｓ．Ａｆｔｅｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｔｈｅ ｌｏｗ，ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ ｗｅｒｅ ｇｉｖｅｎ ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇｓ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｇｉｖｅｎ ｐｕｒｉｉｅｄ ｗａｔｆｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃａｐｓｕｌｅｓ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｇｉｖｅｎ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃａｐｓｕｌｅｓ． Ａｆｔｅｒ ４ ｗｅｅｋｓ ａｎｄ ８ ｗｅｅｋｓ，ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｕｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１ Ｂ，ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ—ｃ【，ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａ１ｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ一３ ａｎｄ ＨＡ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ 慕金项｝＿Ｉ：祸迮省科技厅产学研重大々项（２０１２Ｙ４００６） 作 单他：１．稿建・｝ 医药大学， ￣ＪＪ，ｌ 有限公司，福建 ；欠精熏 ｌ‘ 寅 室，揣建通ｉｌｔ＇ｆ４￣ ：李警杯ｃａｐｓｕｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ 建福州３５０１２２；２．厦门巾 门， 州３６ｌ】００；３．稍建『Ｉｌ西医结合老印忡 ３５０１２２ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１ ｐ，ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ— ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌＯＤｒ０ｔｅｉｎａｓｅｓ一３ Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｘｄｔｃｍ＠１６３．ｃｏｍ ・３６‘ 风湿病与关节炎２０１３年第２卷第ｌ１期Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ａｎｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓ ２０１３，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．１１ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｋｎｅｅ ｊｏｉｎｔ ｓｙｎｏｖｉａ ｏｆ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＨＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｊｏｉｎｔ ｓｙｎｏｖｉａ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅａｃｈ ｄｒｕｇ・ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｈａｄ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｗｈｏｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ—ｌ ｐ．ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ一【Ｉ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ一３． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ｔｏｕｇｕ ｘｉａｏｔｏｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ；ｓｅｒｕｍ；ｓｙｎｏｖｉａｌ；ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；ｒａｂｂｉｔ 透骨消痛方是福建中医药大学刘献祥教授的经 验方，临床上长期用于骨关节炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＯＡ） 院中药制剂实验室生产，为福建中医药大学附属第 二人民医院的院内制剂（Ｚ２０１００００６），由巴戟天、 的治疗，并取得良好效果…。在此基础上研制的 透骨消痛胶囊本课题组在此院内制剂多年临床运用 的基础上，通过提取和制剂工艺的改进，制得疗效 更加确切、服用剂量减少、质量稳定的透骨消痛胶 囊。本实验以兔膝ＯＡ模型血清和关节液中白细胞 介素．１ｐ（ＩＬ．１ｐ）、肿瘤坏死因子．０【（ＴＮＦ．０ｃ）、 基质金属蛋白酶．３（ＭＭＰ一３）和透明质酸（ＨＡ） 的含量为指标 ，考察透骨消痛胶囊治疗兔ＯＡ 的疗效，并揭示其抗炎作用机制。 １ 实验材料 １．１ 实验动物 新西兰兔７２只（合格证号： ２０１２Ａ０２６），清洁级，体质量２～２．５ ｋ譬，均为雌 性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许 可证号ＳＣＸＫ（沪）２０１２—０００２。福建中医药大学 实验动物中心提供清洁级医学实验动物环境设施， 许可证号ＳＣＸＫ（闽）２０１２—０００１。 １＿２仪器ＴＤＬ一８０—２Ｂ离心机，上海安亭科学 仪器厂生产；Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ低温高速离心机，美国 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．生产；ＥＬｘ一８００型全自动酶标 仪与ＥＬｘ ５０／１２全自动酶标洗板机，美国Ｂｉｏ—Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．生产；Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ￣移液器，德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｉｎｃ．生产；Ｈ．１微型混合器，上海康禾光 电仪器有限公司生产；ＤＮＰ一９０８２型电热恒温培养 箱，上海精宏实验设备有限公司生产。 １．３试剂及药物酶联免疫试剂盒（兔血清ＩＬ一 １ｐ、ＴＮＦ一 、ＭＭＰ一３，兔关节液ＩＬ—ｌｐ、ＴＮＦ一０【、 ＭＭＰ．３、ＨＡ），美国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．生产，批号 １２１２１８；戊巴比妥钠，国药集团化学试剂有限公司 生产，批号２０１０１１２９；注射用青霉素钠１６０万ｕ， 华北制药股份有限公司生产，批号２０１２０５２４；质 量浓度０．９％氯化钠注射液，福州海王福药制药有 限公司生产，批号１ １０７２９Ａ０４；超纯水；其他溶剂 均为分析纯。透骨消痛胶囊，福建中医药大学药学 白芍、川Ｉ芎和肿节风４味药材组成，具有补肾柔肝、 活血祛风的作用；盐酸氨基葡萄糖胶囊，奥美 制药厂生产，批号２０１２０９０８）。 ２方法 ２．１ 动物分组将实验用动物随机分为６组，即 空白对照组，模型对照组，盐酸氨基葡萄糖胶囊组 （以下简称阳性药组），透骨消痛胶囊低、中、高 剂量组（以下简称低、中、高剂量组），每组１２只。 每组再随机分为给药４周和８周两组。 ２．２造模方法采用改良Ｈｕｌｔｈ法造模 。经耳 缘静脉注射质量浓度２％戊巴比妥钠３０ ｍｇ・ｋｇ 全身麻醉，术区备皮，常规消毒，行膝关节内侧纵 切口，逐层切开，切断内侧副韧带，打开关节腔， 切除内侧半月板及前后交叉韧带后，缝合关节腔及 皮肤。术后不固定伤肢，任其自由活动，每只兔肌 注４Ｏ万ｕ青霉素钠，连续３ ｄ，以防膝关节感染。 术后１周，每天驱赶使其活动约３０ ａｒｉｎ，连续１个月。 ２．３干预方法空白对照组、模型对照组灌胃纯 化水，阳性药组及低、中、高剂量组灌胃对应药 物溶液５ ｍＬ・ｋｇ～，每日１次，连续４周和８周。 按照《药理实验方法学》中体表面积的方法来折算 给药剂量，兔的等效剂量为人给药量的３．１倍，则 低、中、高剂量分别为０．０７ ｇ・ｋｇ－ 、０．１４ ｇ・ｋｇ－ 、 ０．２８ ｇ・ｋｇ－ ；阳性药为盐酸氨基葡萄糖胶囊，剂量 为０．０７７５ ｇ・ 。 ２．４取材取材前各组动物禁食２４ ｈ，在耳缘静 脉注射质量浓度２％戊巴比妥钠３０ ｍｇ・ｋｇ ’进行全 身麻醉。 ２．４一 血清腹主动脉采血，静置１ ｈ待凝固后， 室温，置３ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心机离心１０ ａｒｉｎ，取上清液， 冷藏于一２Ｏ。Ｃ的冰箱内，待测。 ２．４＿２关节液空气栓塞处死实验动物后，行髌 骨内缘纵行切口，逐层分离，保持术区无出血，分 风湿病与关节炎２０１３年第２卷第１１期Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ａｎｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓ ２０１３，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．１１ ・３７・ 离至关节囊，反复屈伸活动关节，将关节液挤压至 髌上囊内侧，在关节液最集中处轻轻划开关节囊， 向内注入质量浓度０．９％氯化钠注射液１．５ ｍＬ，反 复抽吸ｌ０遍，尽量将液体抽出，注人１．５ ｍＬ中， ４℃，置于１５ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心机离心１５ ｒａｉｎ，冷 藏于一２０℃的冰箱内待测 。 ３结果 ３．１ 模型及关节液外观变化 ３．１．１行为变化造模后，兔均出现跛行，患肢 不愿活动，造模侧膝关节较健侧肿胀。触摸右膝关 节时出现挣扎、弹腿，在空地上驱行时出现右后腿 跛行。空白对照组未出现疼痛行为改变。 ３．１．２关节液的变化正常兔膝关节关节液呈无 色、透明、黏稠状；ＯＡ兔膝关节关节液呈淡黄、 ２．５检测方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附法 （ＥＬＩＳＡ法）。严格按照 ０盒ｆ娴说明书，吸取５０ 稀释标准品、１０ 样品和４０ 样品稀释液分别至 半透明，浓稠，部分标本可见少许白色絮状漂浮物。 ３．１．３模型对照组ＩＬ一１Ｂ、ＴＮＦ一 、ＭＭＰ一３水平的 每孑Ｌ，封板膜封板，３７℃恒温箱避光温育３０ｍｉｌｌ， 全自动酶ｆ，示洗晚 ５次；每孔加入酶 ０ ５ｏ ， 空白孔除外；３７ 恒温箱避光温育３０ ａｒｉｎ，全自动 变化各指标模型对照组与空白对照组比较，差异 有统计学意义（Ｐ＜０．０５），揭示造模成功，且模 型对照组炎症明显。见表１、表２。 ３＿２ 中药对ＩＬ．１Ｂ、ＴＮＦ－ｕ、ＭＭＰ．３和ＨＡ的影响 酶标洗板机洗板５次；每孔先加入显色剂Ａ ５０ ， 再加入显色剂Ｂ ５０ ，轻轻震荡混匀，３７￣Ｃ避光显 色１０ ｍｉｎ；每孔加入终止液５０ ，并于１５ ａｉｒｎ内， 以空白孔调零，在４５０ ｎｉｎ波长依序测定各空的吸光 度（ＯＤ值）。以标准品浓度作为横坐标，ＯＤ值 作纵坐标，计算出标准曲线的４一Ｐａｒａｍｅｔｅｒ回归方 程，将样品的ＯＤ值代入方程式，计算出样品浓度， 再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 ２．６统计学方法采用ＳＰＳＳ １９．０软件进行统计 给药４周，８周阳性药组血清及关节液中ＩＬ—ｌＢ、 ＴＮＦ． 和ＭＭＰ一３浓度明显降低（Ｐ＜０．０５）；低、中、 高剂量组血清及关节液中ＩＬ．１Ｂ和ＴＮＦ一０【浓度有不 同程度的降低，其中高剂量组与模型对照组比较， 差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；低、中、高剂量组 血清及关节液中ＭＭＰ一３浓度显著降低（Ｐ＜０．０５）； 低、中、高剂量组和阳性药组关节液中ＨＡ的含量 逐渐升高，但与模型对照组关节液中ＨＡ的含量比 较，差异无统计学意义（尸＞０．０５）。见表１、表２。 ｎｇ・ｍＬ～。 ±Ｓ 分析。计量资料以 ± 表示，组问差异采用单因 素方差分析。以尸＜０．０５表示差异具有统计学意义。 表１ 给药４周兔ＩＬ一１１３、ＴＮＦ一０【、ＭＭＰ一３和ＨＡ的浓度比较注与空白组比较，１）尸＜０．０５；与模型组比较，２）Ｐ＜０．０５ 表２给药８周免ＩＬ一１１３、ＴＮＦ一【Ｉ、ＭＭＰ一３和ＨＡ的浓度比较ｎｇ・ｍＬ～。 ±Ｓ 注与空白组比较，１）尸＜０．０５；与模型组比较，２）Ｐ＜０．０５ ４讨论 祛风散寒除湿、舒筋活血通络等法则 。透骨消 痛胶囊以巴戟天补肾之品治本为君药；白芍养血柔 肝以助固本为臣药；川芎活血行血、血行风自灭， 肿节风祛风除湿、风祛痹痛止为佐使药，达到标本 ＯＡ属中医学“痹证”范畴，肝肾亏虚为病变 的根本，风寒湿邪是其致痹外因，属于本虚标实、 本痿标痹的病证。临床治疗多采用补肝益肾健脾、
