酸奶中常见真菌的分离、鉴定与快速检测

中国酿造

2018年第37卷第4期

总第314期 *57,

酸奶中常见真菌的分离、鉴定与快速检测

杜莹S潘佩平S李敏

2

,李瑶2,范晓军2*

(1.山西省生物研究所，山西太原030006;2.太原理工大学化学化工学院，山西太原030024)

摘要

:该研究首先对导致酸奶变质的微生物进行分离、鉴定，鉴定结果显示红酵母和根霉菌是最常见的酸奶污染真菌种类。通

过速冻研磨的DNA提取方法获取酸奶中真菌总DNA，在比较了各微生物的检测DNA条形码后，确定了内部转录间隔区(ITS)和大亚 基序列CLSU)这两个基因序列在酵母菌和霉菌的分子检测上均呈现较好的扩增效率，在此基础上建立了红酵母和根霉菌的荧光定 量PCR标准检测曲线，形成了一套乳制品中真菌的快速检测体系，将酸奶中污染真菌的检测时间缩短至5 h。

关键词：酸奶;酵母;霉菌;DNA条形码;快速检测中图分类号：TS262.2

文章编号：02-5071 (2018)04-0057-04

doi:10.11882/j.issn.02-5071.2018.04.011

Isolation, identification and rapid detection of common fungi in yogurt

DU Ying1, PAN Peiping1, LI Min2, LI Yao2, FAN Xiaojun2 *

(l.Biology Institute of Shanxi，Taiyuan 030006, China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering，

Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China)

Abstract: Microbes that caused yogurt deterioration were isolated and identified, and the results showed that Rhodotorula sp. and Rhizopus sp. were

the common fungi that caused yogurt deterioration. Using DNA extraction way of quick freezing grinding, the total DNA of the fungus in yogurt was obtained, after comparing the various microbial detection of DNA barcode, gene sequence internal transcribed spacer (ITS) and large subunit sequences (LSU) showed good amplification efficiency in the molecular detection of yeast and mould, on this basis, the standard detection curve based on real­time PCR method of Rhodotorula sp. and Rhizopus sp. was established. Finally, a rapid detection system for fungi in dairy products was formed, which reduced the detection time of contaminated fungi in yogurt to 5 h.

Key words： yeast; mould; DNA barcode; rapid detection

乳制品是一种营养丰富，容易被人体消化吸收的天然 食品，随着人们生活水平的提高，相关产品已经成为生活 中常见的健康食品。但是营养丰富的乳制品也是各种微生 物青睐的温床，这导致乳制品的保质期非常有限，比如经 巴氏杀菌的乳制品保质期一般不超过7 d(巴氏鲜奶占全球 液态奶70%的市场份额)[1],近些年市场占有量越来越大的 发酵酸奶，其保质期最多也只有21 d[2]。

另一方面，国家《食品安全法》和《企业生产乳制品许 可条件审查细则(2010版)》中明确要求企业必须对所生产、 加工的乳制品进行出厂前微生物检验，包括5种指示菌和 5种致病菌的检测[3]。目前乳制品企业基本都是采用传统 的平板培养法来检测微生物，这种方法的检测周期一般在 3〜5 d左右，甚至有些致病菌不能仅凭菌落形态来判定，需 要配合其他生化反应试验做进一步鉴定，这无疑又增加了 检测周期。作为一种快速、准确的检测方法，荧光定量聚合 酶链式反应（realtime-fuorescence quantitative-polymerase

收稿日期：2017-11-07

修回日期：2018-03-03

chain reaction，RT-FQ-PCR)技术已经被权威部门认可并纳入部分食品微生物检测国标中[4]，尤其是近些年越来越 多的国家标准中采纳了这一方法。如进出口行业对难于培 养的霍乱弧菌、副溶血性弧菌等微生物的检测都是采用荧 光定量PCR技术[5-6]。

荧光定量PCR因其准确、快速等特点，已用于乳品中 微生物快速检测。张巧艳等[7]将这一技术应用于乳制品中 沙门氏菌的检测，将沙门氏菌的检测时间缩短至3 h，但该 方法在3 h的检测下限为100 CFU/mL，在微生物含量较低 的情况下该方法仍然存在一定的假阴性。在酵母的快速检 测上，夏乾峰等[8]建立了一种可以检测5种酵母菌的荧光 定量PCR方法，其优化后的荧光定量PCR检测方法的灵敏 度为5 CFU/mL，然而该方法的检测对象为纯化后的酵母菌， 未深入研究样本类型对检测灵敏度的影响。显然，酸奶作 为一种高蛋白含量的样本类型，在DNA提取过程中存在高 浓度蛋白背景污染的问题，此外，真菌具有较为致密复杂的

基金项目：山西省重点研发计划重点项目（201603D21108)；山西省重点研发计划重点项目（201703D121044)；山西省重点研发计划重点项

目子课题（201603D21108-05)

作者简介:杜莹（1975-),女，助理研究员，本科，研究方向为生物食品。:通讯作者:范晓军（1980-),男，教授，博士，研究方向为工业微生物与分子功能。

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Research Report

细胞壁结构，这些因素都会影响对酵母、霉菌DNA检测的 准确性。目前，使用荧光定量PCR技术检测乳制品中真菌的 研究还鲜有报道。本研究首先对导致酸奶变质的微生 物进行分离、鉴定，通过改良的DNA提取方法，获取酸乳 中微生物总DNA,建立了污染微生物的荧光定量PCR标准 检测曲线，形成了一套乳制品常见微生物的快速检测体系。

1材料与方法 1.1材料与试剂

成品酸奶:市售某品牌酸奶；SYBR Green-qPCR扩増 试剂:北京天根生化科技有限公司。

孟加拉红固体培养基:称取蛋白胨5.0 g,葡萄糖10.0 g, 磷酸二氢钾1.0 g，无水硫酸镁0.5 g,琼脂20.0 g,孟加拉红

0.033 g,加入蒸馏水中，加热融化，补足蒸馏水至1 000 mL,

分装后121 °C灭菌20 min。倾注平板前，用少量乙醇溶解

0.1 g氯霉素加入培养基中。1.2仪器与设备

YXQ-LS-30S2型立式压力蒸汽灭菌锅:上海实业

有限公司;Mastercycler pro S PCR仪:艾本德中国有限公司；

WD-9413C型凝胶成像分析仪:北京市六一仪器厂;DH-360

电热恒温培养箱:北京中兴伟业仪器有限公司;CFX96 Touch 荧光定量PCR仪:美国伯乐生命医学产品有限公司。

1.3方法 1.3.1菌种分离

取10 mL经过巴氏灭菌的新鲜制备的酸奶，开盖置于 空气中，室温放置7 d。待空气中的微生物已经自然沉降至 酸奶上并形成肉眼可见的菌落后，挑取酸奶上出现的不 同形态的菌落至5 mL灭菌蒸馏水中，振荡混匀后取1 mL 涂布至孟加拉红固体培养基上。28 C条件下恒温培养5 d。 固体培养基上长出菌落后挑取至孟加拉红液态培养基中 扩培。

1.3.2菌种鉴定

取1 mL经过步骤1.3.1制备的菌液，离心后将沉淀物置 于-80 C中冷冻30 min，随后采用十六烷基三甲基溴化铵

(cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB)法抽

提沉淀菌体的DNA。用真菌ITS扩増通用引物ITS5 (5’-GG-

AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4 (5'-TCCQCC-

GCQTATTGATATGC-3')对提取的DNA进行扩増[9]，扩増

产物经纯化后进行Sanger上机测序。将测序结果在NCBI 数据库中Blast同源比对检索，查找与被测菌种在ITS序列 相似性最高的物种。

1.3.3 DNA条形码确定

在进行物种DNA鉴定时，首先选择最佳的DNA扩増片 段，不同的DNA序列存在不同的扩增效率和区分层次[10]。 针对1.3.1分离鉴定出来的微生物，为了选择一个合适的基 因片段作为荧光定量PCR检测靶点，本研究选取了 4个较为

常用的基因片段进行扩增效率比较，分别为P-tubulin[11]、

尺?31[12]丄8^13]、!^，针对四个片段设计的？匚尺引物及序

列见表1。

表1

PCR引物序列设计

Table 1 Sequences design of PCR primers

基因片段引物名称引物序列(5’—3)

p-tubulin

Bt2aGGTAACCAAATCGGTGCQGCQTTCBt2bACCCQCAGTGTAGTGACCCQTGGCRPB1

gRPB-FGADTGTCCKGGWCATTTTGGfRPB-RCNGCDATNTCRTTRTCCATRTAITS

ITS5GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG GITS4TCC TCC GCQ TAT TGA TAT GCLSU

LR0RACC CGC TGA ACQ TAA GCLR5

TCC TGA GGG AAA CQT CG

1.3.4荧光定量PCR检测体系

将扩培的真菌原液进行梯度稀释，分别稀释10、1〇2、

103、104倍，取104倍稀释的菌液100 ^L涂布于孟加拉红固体

培养基上，28 C条件下培养至形成了明显菌落并且菌落 未连在一起的时候，对菌落进行计数。

将上述梯度稀释后的菌液各取100 ^L，加入到500 ^L 灭菌酸奶样品中，充分混勻后12 000 r/min离心5 min，去上 清液，将沉淀物放入-80 C冰箱中冷冻30 min后进行液氮研 磨，用1.3.2中描述的方法抽提各稀释浓度梯度下的微生物

DNA。用1.3.3实验步骤确定的最佳扩増基因片段，对各浓

度梯度下提取的DNA进行SYBR Green-qPCR扩増，记录每 个反应的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Cq 值及对应的荧光检测值。建立检测菌数与Cq值的关联曲线。 结合DNA提取的洗脱液体积70 ^L及PCR时可用最大模 板量18…，指出检测菌数X的计算公式为Nx18/70xr，其中

N为平板计数结果，r为稀释倍数[14\"15]。

SYBR Green-qPCR的反应体系（20 pL) : EvaGreen 2x qPCR MasterMix10 pL，正向引物10 pmol/L 1 pL，反向弓|

物 10 pmol/L 1 pL，基因组模板 18 pL。SYBR Green-qPCR 反应条件为：95 C、3 min，进入36个循环(95 C、15 s，56 C、

30 s，72 C、30 s)，在72 C延伸阶段进行荧光采集，最后72 C

恒温5 min。

2结果与分析

2.1微生物分离与鉴定结果

酸奶置于空气中静置7 d后，发现9个肉眼可见的菌 落，将其转移至孟加拉红培养基纯化、扩培，经ITS序列鉴 定这9个菌落分别属于红酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌

(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)这三种菌种（菌落

形态参见图1)，其中红酵母出现的概率最大，具体真菌鉴 定结果参见表2。

研究报告

中国酿造

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PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2。由图2

结果可知，ITS和LSU这两个基因片段在酵母和霉菌均呈 现较好的扩增效果，而另两种基因片段扩增失败，因此将ITS 和LSU作为快速检测酸奶中真菌的DNA条形码。

2.3荧光定量PCR快速检测体系

在完成各菌液浓度梯度的技术和计算后，将其回接至

I

图1

n

n

酸奶中，按照上述方法提取真菌基因组DNA，利用ITS片 段作为检测靶点，进行荧光定量PCR检测并收集相关数据， 各浓度梯度的真菌均得到了完整的扩增曲线，具体检测菌 数与Cq值参见表3。

表3

不同浓度的真菌检测数量与Cq值

i:红酵母平板；n:青霉菌平板；m:根霉菌平板

三种纯化真菌平板菌落形态

Fig. 1 Colonial morphology of three purified fungi plates

表2

酸奶污染真菌基于丨TS序列鉴定结果

Table 2 Identification results of fungi in yogurt based on ITS sequence

样本测序编号

N1N2N3N4N5N6N7X1X2

拉丁属名RhodotorulaRhodotorulaRhodotorulaRhodotorulaRhodotorulaRhodotorulaPenicilliumRhizopusRhizopus

中文属名酵母酵母酵母酵母酵母酵母青霉菌根霉菌根霉菌

拉丁种名diobovatadiobovatadiobovatadiobovatadiobovatadiobovatacommuneoryzaeoryzae

ITS序列相似性/%

100100100100100100100100100

Table 3 Determination results of different fungi concentration and

Cq value

红酵母检测数量与Cq值菌数计数结果 X/(CFU*mL-1)

lgX0.1071.1072.1073.1074.107

Cq值

根霉菌检测数量与Cq值菌数计数结果X/(CFU*mL-1)

2850

lgX1.8652.8653.86.8655.865

Cq值31.1332.5234.0834.4637.03

505005X00050*000500*000

35.1435.2236.14

36.84

28*500

285 0002 850 00028 500 000

37.01

将表3两种真菌的被检数量对数值lgX ()与检测采集 的Cq值（)进行关联分析，并得出两者之间的拟合关联方 程式，具体关联结果分别参见图3。

由此可见，酸奶常见的真菌污染类型以酵母和霉菌为 主，其中酵母出现概率更大，在酸奶的实际的加工生产环 境中，要重点预防空气中红酵母(Rhodotoruh sp.)和根霉 菌(RMzopus sp.)的污染。

2.2检测DNA条形码的确定

M 1 2

3 4

5

M 1 2

3

4

5

5 000 bp

3 000 bp 2 000 bp

1 000 bp

750 bp

500 bp 250 bp

100 bp

M: Marker; 1: ITS; 2: RPB1; 3: LSU; 4: p-tubulin; 5:空白对照图2

酵母菌N1及根霉菌X1 4种PCR产物凝胶电泳图

Fig. 2 Gel electrophoresis of four PCR products from yeast N1 and

Rhizopus sp. X1

分别提取表2中的编号为N1酵母菌和编号为X1根霉 菌基因组，作为PCR扩增模板，用表1中设计的PCR引物分 别进行PCR扩增及电泳检测，以选取最佳的DNA检测片段。

图3

红酵母(A)与根霉菌(B)检测数量与Cq值关联曲线

Fig. 3 Correlation curve between count and Cq value of

Rhodotorula sp. (A) and Rhizopus sp. (B)

•60.

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参考文献：

Research Report

通过图3的趋势线可知，随着真菌数量的增加，检测系 统的荧光值也在随之升高，这说明荧光强度与真菌数量存 在很强的关联性，通过绘制与荧光值相对等的Cq值和真 菌数量的对数值之间的关联曲线，在红酵母50 CFU/mL到

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50xl04 CFU/mL的5个数量级之间获得相关系数为0.936 2的

良好线性关系曲线（图3a)，回归方程为Y=0.536X+34.462 (Y代表系统检测到的Cq值，X代表红酵母数量的对数值)。 在根霉菌2 850 CFU/mL到2 850xl04 CFU/mL的5个数量级 之间获得相关系数为0.958 1的良好线性关系曲线(图3b)，回 归方程为Y=1.374X+29.722 (Y代表系统检测到的Cq值，X代 表根霉菌数量的对数值)。10次重复检测500 CFU/mL红酵母 获得的相对标准偏差为3.7%，10次重复检测28 500 CFU/mL 根霉菌获得的相对标准偏差为3.2%，说明此体系对该类型 真菌的检测重复性较好。综上所述，本研究所构建的荧光 定量检测体系，可在5 h完成酸奶样品中真菌核酸的荧光定 量检测，获得检测Cq值后根据各自的关联方程可推算出样 品中的真菌数量。3结论

本研究首先明确了空气中能造成酸奶污染的真菌种 类，红酵母(Rhocfotoruia sp.)、青霉菌(Peniciffium sp.)、根 霉菌(RMzopussp.)是三种能在酸奶中生长的真菌种类， 其中红酵母最为常见，在实际的酸奶加工生产中应该重点 预防。本研究的真菌分离鉴定结果对乳制品加工企业在真 菌污染防治上提供了针对性参考。

在酸奶污染真菌的DNA快速检测技术流程上，本研究 首先解决了真菌破壁困难、乳品高蛋白背景的基因组抽提 问题，并进一步比较了不同基因片段的PCR扩增效率，明确 了适合酸奶污染真菌的最佳检测DNA条形码和条件，在 此基础上建立了初始检测真菌数量与荧光信号值之间的 关联，形成了一套酸奶真菌DNA快速检测体系。相比传统 培养检测方法，本研究所形成的快速检测体系，检测流程 缩短了检测时间至5 h内，加快了酸奶的出厂时间，从而也 延长了酸奶的货架期。

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