西部医学２０１３年４月第２５卷第４期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．４ ・４９３・ 缬沙坦对心肌成纤维细胞转化生长因子 和结缔组织生长因子表达的影响 姜关华 ，徐友平 ，姚国乾 ，韩志武 ，涂玲。 （１．第１６１医院，全军血液净化中心，湖北武汉４３００１２；２．华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科，湖北武汉４３００３０） 【摘要】 目的 通过体外培养新生大鼠心肌成纤维细胞研究缬沙坦对转化生长因子Ｂ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ￣，ＴＧＦ－￣）和结缔组织生长因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＣＴＧＦ）表达的影响。方法胶原酶消化法分离心 肌成纤维细胞（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＣＦｓ），构建ＡｎｇⅡ诱导ＣＦｓ的心肌纤维化细胞模型。各观察点以不同浓度的缬沙坦 干预模型，光镜下观察细胞生长状况。采用ＭＴＴ比色法检测缬沙坦对ＣＦｓ增殖的影响，ＡＯ／ＥＢ染色法分析ＣＦｓ活力， 电镜下研究亚细胞结构；采用反转录聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）技术测定ＣＦｓＴＧＦ－１３１及ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ的表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法测定ＴＧＦ－￣Ｉ、ＣＴＧＦ蛋白的表达。结果 光镜下可见：ＣＦｓ于种植２４ｈ后完成贴壁，ＡｎｇＩＩ干预后的细胞显著增 殖，不同浓度的缬沙坦处理后的细胞２４ｈ内均表现为凋亡。ＭＴＴ及ＡＯ／ＥＢ染色表明缬沙坦浓度为１０ｐ．ｍｏｌ／Ｌ干预８ｈ 抑制增殖效应最为显著。Ａ０／ＥＢ染色及电镜结果提示其作用机制为诱导细胞凋亡。ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ结果显 示，上述条件下，ＣＦｓ中ＴＧＦ－￣和ＣＴＧＦ表达明显下调。结论 缬沙坦浓度为ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ作用８ｈ后ＣＦｓ凋亡率最高， 其作用机制与ＴＧＦ－［￣及ＣＴＧＦ的表达下调有关。 【关键词】心肌纤维化；缬沙坦；血管紧张素Ⅱ；转化生长因子０；结缔组织生长因子 【中图分类号】Ｒ ３３１．３ １ 【文献标识码】Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—３５１１．２０１３．０４．００４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｌｓａｒｔａｎ ｏｎ ＴＧＦ。 ａｎｄ ＣＴＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ＪＩＡＮＧ Ｍｅｉ－ｈｕａ。，ＸＵ Ｙｏｕ－ｐｉｎｇ ，ＹＡＯ Ｇｕｏ－ｑｉａｎ ，ｅｔ ａｌ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ １６１ｔｈＨｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＰＬＡ，Ｗｕｈａｎ ４３００１２，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｎｔｅｒｇｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００３０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔｌ ０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＣＦｓ）ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｌｓａｒｔａｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ８（ＴＧＦ－￣）ａｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＣＦｓ ｗｅｒｅ ｉ— ｓｏｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｏｄｅ１，ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ １１（Ａｎｇ １１）ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ ｍｏｄｅ１ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｅｖｅｒａ１ ｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｌｓａｒｔａｎ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｉｎ．Ｔｈｅ ＣＦｓ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｂｙ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｅｒｖｅｎ— ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＦｓ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｍ１ｖｒ ａｓｓａｙ ａｎｄ ＡＯ／ＥＢ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓ— ｃｏｐｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－￣ａｎｄ ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ＿ＰＣＲ）ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＣＦｓ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ａｄｈｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｇｒｏｗｉｎｇ ２４ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ＣＦｓ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ ＡｎｇＩ１ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎ．Ｂｅｉｎｇ ｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｌｓａｒｔａｎ。ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａ１ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｅｎ ｗｉｔｈｉｎ ２４ ｈｏｕｒｓ ｉｎ ｐａｒｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦｓ．ＭＴＴ ａｓｓａｙ ａｎｄ ＡＯ／ＥＢ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｖａｌｓａｒｔａｎ ａｔ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ ｈａｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＣＦｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｆｔｅｒ ８ ｈｏｕｒｓ．ＡＯ／ＥＢ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓ— ｃｏｐｙ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＦｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｄｅａｔｈ．Ｉｔ ｉｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ，ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ＴＧＦ－￣ａｎｄ ＣＴＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＦｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｏｆ ＣＦｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｈｉｌｅ ｖａｌｓａｒｔａｎ ａｔ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０／￣ｍｏｌ／Ｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ８ ｈｏｕｒｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－￣ａｎｄ ＣＴＧＦ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＭＦ）Ｖａｌｓａｒｔａｎ；ＡｎｇｌＩ；ＴＧＦ－１３；ＣＴＧＦ 心肌纤维化（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＭＦ）是各种心 血管事件发生的危险因素，主要表现为胶原纤维 过度沉积、心肌成纤维细胞（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＣＦｓ） 数目增多叫。ＣＦｓ能大量合成分泌基质蛋白、胶原纤 西部医学２０１３年４月第２５卷第４期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．４ 维［２］，因此诱导ＣＦｓ凋亡成为当前研究抗ＭＦ的热 点。大量文献从整体水平上提出ＡＲＢ类药物减轻 ＭＦ分子机制的假说［３］，但尚未通过体外实验证实。 本研究计划通过构建心肌纤维化细胞模型，探索ＡＲＢ 类药物减轻心肌纤维化的最佳局部药物浓度和时间， 并通过测定心肌成纤维细胞在干预前后ＴＧＦ一８及 ＣＴＧＦ的表达，进一步研究ＡｎｇⅡＴＧＦ—Ｂ１、ＣＴ— ＧＦ表达的分子机制以及ＡＲＢ类药物生物学作用机 理，从而初步揭示ＡＲＢ类药物治疗心肌纤维化的分 子机制。 １对象与方法 １．１ 实验动物与试剂 同济医院动物中心ＳＤ大鼠 新生乳鼠。缬沙坦干粉购自北京诺华公司（甲醇溶 解）；血管紧张素Ⅱ（超纯水溶解）、ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ设备为Ｂｉｏｒａｄ公司产品。Ｉ３一ａｃｔｉｎ抗体 和ＴＧＦ－￣、ＣＴＧＦ抗体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。 １．２方法 １．２．１ 建立并鉴定心肌纤维化细胞模型 胶原酶消 化心肌组织，差速贴壁法分离ＣＦｓ。取生长对数期的 ３～４代ＣＦｓ种于９６孔板，细胞融合６Ｏ 以上时，无 血清培养１２ｈ。随机分为空白对照组和心肌纤维化细 胞模型组（细胞培养液中加入１０一￣ｍｏｌ／Ｌ ＡｎｇＩＩ）。 光镜下观察２４ｈ后两组细胞生长状况，并采用ＭＴＴ 比色法鉴定细胞模型的建立是否成功。 １．２．２缬沙坦抑制ＡｎｇＩＩ作用的ＣＦｓ增殖最佳浓度 及作用时间的筛选 １．２．２．１ ＭＴＴ、Ａ０／ＥＢ（吖啶橙／溴化乙锭）染色法 鉴定细胞活力 将模型组细胞分为：以０．０１￣ｍｏｌ／Ｌ、 ０．１“ｍｏｌ／Ｌ、ｌ￣ｍｏｌ／Ｌ、ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ、ｌＯ０￣ｍｏｌ／Ｌ的缬沙 坦处理的５个治疗组和溶酶组（每孑Ｌ加入甲醇２ｕ１）以 及增殖对照组。光镜下观察缬沙坦干预后４、６、８、１２、 ２４ｈ细胞活力。ＭＴＴ法分析细胞抑制率。ＡＯ／ＥＢ染 色计算细胞凋亡率。 １．２．２．２ 透射电镜观察干预前后模型细胞亚细胞结 构的改变取ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ缬沙坦干预８ｈ的治疗组细 胞。胰酶消化后离心收集细胞悬液后弃上清，经同济 医学院病理科制作切片后透射电镜下观察、摄片。 １．２．２．３ ＲＴ—ＰＣＲ检测ＴＧＦ＿Ｇ及ＣＴＧＦｍＲＮＡ水 平的表达状况在这一研究基础上，我们把细胞分为 三组；原代培养的细胞作为正常对照组，ＭＦ模型细 胞组作为对照组，而实验组细胞则为ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ缬沙 坦干预８ｈ后的模型细胞。分别提取三组细胞总 ＲＮＡ。取其中１ ｇ，根据试剂盒提供的实验条件进行 ＲＴ—ＰＣＲ反应。应用ＯＵＧ０ ６．７１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃ０，ＵＳＡ）软件设计：ＣＴ— ＧＦ引物序列分别为：上游５１＿ＣＴＡＡＧＡＣＣＴＧＴＧ— ＧＡＡＴＧＧＧＣ一３ ；下游５ 一ＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴ— ＧＣＣＣＣＣ一３ （扩增片段长３８３ｂｐ）。８一ａｃｔｉｎ［４］引物序列 分别为：上游５ 一ＧＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＡ一３ ； 下游５『＿ＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ－３ （ 扩增片段长６３０ ｂｐ）。ＴＧＦ一８引物序列分别为：上游 ５ 一ＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡ一３ ，下游５ 一 ＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＣＧＣＴ一３ ［。］（扩增片段长 ２９０ｂｐ）。取５肚１产物于１ 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成 像系统分析各条带强度，以Ｂ—ａｃｔｉｎ的ＰＣＲ扩增作为 内参照。 １．２．２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测ＴＧＦ—Ｂ及ＣＴＧＦ蛋白水 平的表达状况胰酶消化三组细胞，三去污法提取总 蛋白，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，取ｌＯＯ￣ｇ，８ 的聚 丙烯酰胺凝胶电泳，一抗孵育４℃过夜，二抗３７℃孵育 １ ｈ，ＥＣＬ化学发光显色，检测出ＴＧＦ一８和ＣＴＧＦ蛋 白的表达；用ＢＩＯ—ＰＲ０ＦＩＦ图像分析系统进行吸光 度扫描，计算ＴＧＦ— ／ —ａｃｔｉｎ和ＣＴＧＦ／￣一ａｃｔｉｎ的比 值。 １．３统计学分析各组数据以 ±ｓ表示，组问差异 用ｔ检验。采用ＳＰＳＳ １１．５统计系统处理，Ｐ＜０．０５ 为有统计学意义。 ２ 结果 ２．１心肌纤维化细胞模型的构建及鉴定 光镜下观 察ＣＦｓ在种植２４ｈ后贴壁基本完成，形态符合其生长 方式。抗波形蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色法 鉴定为阳性，阳性细胞占９８．５ 以上。加人ＡｎｇⅡ ２４ｈ后光镜下可见模型组细胞生长密集。 ２４ｈ后模型组ＭＴＴ—ＯＤ值为（Ｏ．３１４５±０．０１４）明 显高于空白对照组（０．２２１５±０．０１８），具有显著性差 异（Ｐ＜０．Ｏ１），说明本实验成功构建心肌纤维化细胞 模型。 ２．２探索缬沙坦抗增殖效应的最佳治疗方案 光镜 下观察，不同浓度缬沙坦干预后的模型细胞在各观察 点均表现为凋亡：如体积缩小，间隙增大，“出芽”及脱 壁悬浮等。ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ缬沙坦干预８ｈ细胞凋亡现象 最为显著。ＭＴＴ比色法提示：６ｈ后，不同浓度的缬沙 坦对模型组细胞均具有明显抑制作用，且呈浓度依赖 性，细胞抑制率均高于溶酶对照组（Ｐ＜０．０５）（见图 １Ａ），１Ｏ肚ｍｏｌ／Ｌ缬沙坦干预８ｈ后细胞抑制率最高为 （３６．９７±２．Ｏ５４）９，６（见图１Ｂ），说明该治疗方案抗增殖 效应最明显。 西部医学２０１３年４月第２５卷第４期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．４ 过自分泌和旁分泌方式诱导ＣＴＧＦ的分泌，ＣＴＧＦ可 能是ＴＧＦ—ｌ３下游的效应介质。因此，ＣＴＧＦ可能参与 展，进一步探索ＡｎｇＩＩ致心肌纤维化的途径。②研究 ＡｎｇＩＩ通过ＴＧＦ—Ｂ１、ＣＴＧＦ致心肌纤维化的具体信号 传导通路。③研究ＣＴＧＦ在ＭＦ中所起的作用和其 具体作用机理。④深人探讨联合用药方案治疗心肌 纤维化的具体作用机制。 【参考文献】 魏峰涛，陆惠华，方宁远，等．血管紧张素Ⅱ与高血压心肌纤维 介导ＴＧＦ—Ｉ３致纤维化的信号传导通路［１引。相关实验 表明尚存在其他诱导ＣＴＧＦ分泌的通路［１ ，同时 Ａｎｇ １１能刺激ＴＧＦ—Ｂ的活化并诱导其分泌合成［１ ，故 专家推测ＡｎｇⅡ可能参与调节ＣＴＧＦ的表达。 ＡＲＢ是近年临床工作中治疗心肌纤维化的重点 药物。动物实验数据表明：它能阻断ＡｎｇｌＩ和ＡＴ１受 体亚型结合，从而抑制心肌纤维化效应［３ ；同时促进 化关系的研究进展［Ｊ］．医学综述，２００３，９（１１）：６６８—６７０． ＡｎｇｌＩ和ＡＴ２结合，起到逆转心肌重构的作用。 本研究可见，缬沙坦可显著抑制心肌成纤维细胞 生长，ＡＯ／ＥＢ染色和电镜显示各治疗组细胞损伤均 以凋亡为主。ＭＴＴ和ＡＯ／ＥＢ染色显示，缬沙坦浓度 为１Ｏ／２ｍｏｌ／Ｌ作用８ｈ后细胞抑制率及凋亡率均为最 高。ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ的结果显示：ＴＧＦ—Ｂ、Ｉ］＝ｌ ］ ］ ＣＴＧＦ在各组心肌成纤维细胞中均能表达，在ＭＦ模 型细胞组细胞中，两者的表达较正常对照组显著上 调；而在实验组细胞中，两者的表达不仅较模型组细 胞低，较正常组细胞也显著降低（Ｐ＜０．０１）。因而，我 们可以推断：①心肌成纤维细胞自身可以合成ＴＧＦ— Ｂ、ＣＴＧＦ，通过自分泌途径促进其正常生长分化。② ＡｎｇⅡ可通过促进ＴＧＦ－ｔ３、ＣＴＧＦ表达上调进而促进 心肌纤维化。③ＡＲＢ类药物缬沙坦能有效降低心肌 成纤维细胞中ＴＧＦ—Ｊ３、ＣＴＧＦ表达，其具体机制可能 为：①通过选择性地与ＡＴ１受体结合而直接抑制ＣＴ— ＧＦ。②通过选择性地与ＡＴ１受体结合阻断了ＴＧＦ－￣ 的表达增多，从而间接影响了ＣＴＧＦ的表达。 ４ 结论 本研究在成功构建心肌纤维化的细胞模型后给 予缬沙坦干预，筛选出最佳局部作用浓度和时间；而 后，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ技术检测 ＴＧＦ－￣、ＣＴＧＦ在各组心肌成纤维细胞中的表达状况， 明确了ＡｎｇＩＩ是通过ＴＧＦ一１３１、ＣＴＧＦ调节发挥致纤 维化作用的，但是否有其它因素如哺乳类动物雷帕霉 素靶蛋白（ｍＴＯＲ），玻璃体结合蛋白受体ａｖｅ３整合素 信号通路等参与其间还有待进一步的研究。本实验 在细胞水平证实了ＡＲＢ能抑制ＡｎｇＩＩ诱导的两种细 胞因子的表达，但传导通路尚不明确；同时，ＡｎｇｌＩ通 过ＴＧＦ一８１部分调节ＣＴＧＦ表达的信号转导通路和 ＣＴＧＦ自身信号传导通路的研究并不充分。临床上 联合用药为最普遍的治疗方案。因此，我们可以在构 建成功的纤维化细胞模型上进一步研究联合用药的 最佳作用浓度、时间并进而研究其具体的分子机制。 故将来可以开展的研究领域有：①在构建成功的心肌 纤维化细胞模型上，结合国内外心肌纤维化的研究进 苏兴利。朱伟军．心肌成纤维细胞在血管紧张索ＩＩ致心脏间质 纤维化中的作用［Ｊ１．心脏杂志，２００３，１５（２）：１６３—１６４． 王平，宁靓．氯沙坦与卡托普利治疗原发性扩张型心肌病 的疗效比较［Ｊ］．中西医结合心脑血管病杂志。２００５，３（１１）： １０２１—１０２２． Ｍｕｒｐｈｙ Ｍ，Ｇｏｄｓｏｎ Ｃ，Ｃａｎｎｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃ— ｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ａ ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉ］ ｏｎ ｏｆ ｃｏｎｎｅｃｔｉ］ ｖｅ ｔｉｓｓｕｅ］ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ］ ｏｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅｓ ｉ］ ｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４；５８３０—５８３４． Ｗａｎｇ ＹＲ，Ｋｒａｍｅｒ Ｓ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ＳＬＯＷＳ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｎｔｉ－ｔｈｙｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏ－ ｓｉｓ［Ｊ］．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００５，６８：４７—６１． Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ａ，Ｎｉｓｈｉｋｉｍｉ Ｔ，Ｙｏｓｈｉｈａｒａ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄ— ｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏ－ ｐｈｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，１９９９，３３（５）：１１４６—１１５２． 张萍，何国祥。迟洛湘，等．血管紧张素受体与心肌胶原代谢 关系的研究［Ｊ］．高血压杂志，２００１，９（２）：１４８—１５０． Ｐｉｅｔ Ｆ，Ｋａｉｊａ Ｉ，Ｊｕｈａｎｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉｆ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｎｎｅｅ— ｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ—－ｄｅｐｅｎｄ—・ ｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００３，１６３：３５５—３６６． Ｂｒａｄｈａｍ ＤＭ，Ｉｇａｒａｓｈｉ Ａ，Ｐｏｔｔｅｒ ＲＬ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｍｉｔｏｇｅｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕ— ｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｒｃ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ［Ｊ］．Ｃｅｆ １０ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９１，１１４：１２８５． Ｋｏｎｄｏ Ｓ．Ｋｕｂｏｔａ Ｓ，Ｅｇｕｃｈｉ Ｔ。ｅｔ ａ１． Ｃｈａｆａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｃｔｇｆ ３＇－ＵＴＲ ｓｅｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［刀．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，２７８：１１９． Ｆａｎ ＷＨ，Ｐｅｃｈ Ｍ，Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ ＭＪ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，７９：９１５． Ｃｈｅｎ ＭＭ，Ｌａｍ Ａ，Ａｂｒａｈａｍ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．ＣＴＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＴＧＦ一１３ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，２０００，１０： １８０５－１８１９． Ｍａｒｙ Ｓ Ｈａｍｍｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｃ Ｌｉｅｓｋｅ，Ｓｈａｓｈｉ Ｐａｗａｒ，ｅｔ ａ１．Ｃａｌｃｉｕｍ ｏｘａｌａｔｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｒｙｓｔａｌｓ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｋｉｄｅｎｙ Ｉｎｔ，１９９５，４８：５０１—５０９． Ｆｒｅｅｄｍａｎ ＢＩ，Ｙｕ Ｈ，Ｓｐｒａｙ ＢＪ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ ［Ｊ］．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，１９９７，５１：８１９—８２４． （收稿日期：２０１３—０１—０９；编辑：陈舟贵） Ｉ！Ｉ］Ｉ＝Ｊ Ｉ＝１
