江苏农业科学２０１０年第６期 一８９一 胡海英，吴晓玲，严秀蕊．老瓜头离体根与毛状根的诱导培养［Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（６）：８９—９１ 老瓜头离体根与毛状根的诱导培养 胡海英 ，吴晓玲 ，严秀蕊 （１．宁夏大学科技处，宁夏银川７５００２１；２．宁夏大学生命科学学院，宁夏银川７５００２１） 摘要：以老瓜头茎段为外植体筛选诱导离体根再生的最适培养基，以老瓜头茎段和叶片为外植体筛选发根农杆 菌介导的毛状根诱导产生的最适条件，为老瓜头毛状根的大量培养及有效成分利用提供前期的试验参考。结果表明， 添加ＮＡＡ的ＭＳ培养基诱导老瓜头离体根再生的效果明显，带腋芽茎段的生根率可达到１００％，不带腋芽的茎段生根 率为６７．５％；含有ＩＢＡ的培养基上，带腋芽的茎段生根率低，只有３．９％，不带腋芽的茎段无根生出。以发根农杆菌 Ａ４菌株介导的老瓜头毛状根诱导过程中，用‰ ＝０．８的菌液侵染叶片１５ ｒａｉｎ，诱导率及诱导密度最高，分别为 １００％和４．６；用Ｄ 。 ＝０．８的菌液侵染茎段（不带腋芽）１５ ｒａｉｎ时，诱导率最高达４６．７％。老瓜头茎段在添加ＮＡＡ 的ＭＳ培养基上容易生根；最适转化条件为发根农杆菌Ａ４菌液浓度Ｄ 除菌；叶片是遗传转化最适外植体。 关键词：老瓜头；离体根再生；发根农杆菌；毛状根诱导 中图分类号：￥５６７．９０４．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１０）０６—００８９—０２ ＝０．８，侵染１５ ｍｉｎ，８００ ｍｇ／Ｌ头孢噻肟钠 老瓜头（Ｃｙｎａｎｃｈｕｍ ｋｏｍａｒｏｖｉｉ）为萝蓐科鹅绒藤属多年生 １．２ 方法 草本植物，别名牛心朴子，为宁夏道地药用植物…，广泛分布 于次生沙漠中的半固定沙丘和荒漠流沙区，为强旱生适阳植 １．２．１老瓜头离体根的再生将老瓜头的茎剪成０．５— １．０ ｃｍ茎段（包括不带腋芽和带腋芽２种），分别置于添加 ＮＡＡ（０．５、１．０、２．０ ｍｇ／Ｌ）、ＩＢＡ（０．５、１．０、２．０ ｍｇ／Ｌ）的 物，喜光，极为耐旱，耐高温。在医学上老瓜头提取物有抗炎、 抗菌、抗肿瘤及镇痛等作用，民间用于止痛、杀虫，藏医用于退 ＭＳ 、１／２ＭＳ培养基中培养，３５ ｄ后，统计愈伤诱导率和生根 率。光照时间１６ ｈ／ｄ，光照强度２ ０００ ｌｘ，温度（２５±１）℃。 １．２．２老瓜头毛状根的诱导 １．２．２．１发根农杆菌的活化将Ａ４菌株在ＹＥＢ培养基上 烧、止泻，也用于治疗胆囊炎。农业上，老瓜头中提取的生物 碱对蚜虫、菜青虫有一定预防作用，并对烟草花叶病毒有特殊 功效 。因此，将老瓜头提取物通过生物技术大量生产，研 制开发成为新型无公害农药，使其由荒漠野生植物变为经济 划线，２８℃培养，直到长出单个菌落。挑取单菌落于５ ｍＬ ＹＥＢ培养液中，１２０ ｒ／ｍｉｎ摇菌３６ ｈ，按１％的量将摇好的菌 液接种于ＹＥＢ培养液中，继续培养至％ 为０。６—０．８ 。 植物具有可行性，如果建立相关的生产技术体系，老瓜头的利 用和开发前景将十分广阔。２０世纪８０年代以来，在植物细 胞培养技术领域中发展了一种新的培养系统，即Ｒｉ质粒载体 法，它是由发根农杆菌感染双子叶植物后，Ｒｉ质粒的Ｔ—ＤＮＡ 片段整合到植物细胞核基因组中，在Ｔ—ＤＮＡ上至少有ｒｏｌＡ、 １．２．２．２外植体的转化将活化后的发根农杆菌培养物于 ６ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，用ＭＳ液体培养基悬浮，使其 Ｄ 分别为０．５、０．８、１．２。预培养的植物材料分别放人３种 不同浓度的菌液中进行侵染，设计不同侵染的时间，分别为 ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、ｒｏｌＤ等４个基因，其整合和表达的结果导致了大量 毛状根的产生 。利用此项技术进行老瓜头毛状根诱导培 养方面的研究还未见相关报道０。 。本试验以老瓜头的茎段 ５、１０、１５、２０ ｒａｉｎ，侵染后，取出外植体置于ＭＳ固体培养基共 培养（以未感染的茎切段、叶片作对照）。培养３ ｄ后，开始有 和叶片为外植体，研究其离体根发生和发根农杆菌介导的毛 状根发生的技术，筛选出适合的诱导培养条件和方法，为老瓜 头毛状根的大量培养和有效成分利用提供试验参考。 １材料与方法 １．１ 材料 农杆菌菌落出现，这时将外植体转接入含头孢噻肟钠 （１ ０００、８００、６００ ｍｇ／Ｌ）的培养基上培养，每隔５ ｄ转接１次， 头孢噻肟钠的浓度逐渐降低，直至无菌。光照时间１６ ｈ／ｄ，光 照强度２ ０００ ｌｘ，温度（２５±１）℃。 １．３数据统计 按照以下公式计算毛状根诱导率和诱导密度：毛状根诱 老瓜头无菌组培苗，宁夏大学生命科学学院组培室提供。 发根农杆菌Ａ４菌株，购自中国农业科学院农业资源与农业 区划研究所。 导率＝产生毛状根外植体数／总外植体数Ｘ １００％；毛状根诱 导密度＝产生毛状根的总数／产生毛状根的外植体数。 ２结果与分析 ２．１不同外源生长素对老瓜头茎段生根的影响 收稿日期：２０１０—０４一Ｏ８ 基金项目：宁夏大学科学研究基金（编号：ＺＲ２００８３２）。 由表１可见，不带腋芽的茎段在添加不同生长素的ＭＳ 和１／２ＭＳ培养基中，均能诱导出愈伤组织，在添加ＮＡＡ的培 作者简介：胡海英（１９７６一），硕士，讲师，主要从事植物生物技术研 究。Ｔｅｌ：（０９５１）２０６１３５１；Ｅ—ｍａｉｌ：ｈａｉｙｉｎｇ＠ｆｌＸＨ．ｅｄｕ．ｃｎ。 养基中容易诱导根生出，其根多数由愈伤上长出，生根率最高 可达６７．５％；在添加ＩＢＡ的培养基中，愈伤诱导率很低且极 一９０一 江苏农业科学２０１０年第６期 少有根生出，只在１／２ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ的培养基中愈伤率 表２不同侵染菌液浓度与侵染时间对叶片、茎段诱导发根的情况 达６５．８％，生根率为３．９％，其他组合中均无根生出。带腋芽 的茎段在２种培养基及不同浓度的生长素下均能够生根，不 同浓度的ＮＡＡ诱导下生根率均达１００％。由此可见，ＮＡＡ适 合于诱导老瓜头离体根的再生。 ２．２老瓜头不同外植体毛状根的诱导培养 如图１所示，叶片经感染转化培养１５ ｄ后，在叶片的伤 口处及叶柄部开始长出白色的毛状根，毛状根在空气中呈短 刺放射状生长，无向地性；在未经感染的叶片对照试验中，叶 片逐渐变黄、枯死。如图２所示，茎段经感染转化培养１０ ｄ 后，从茎段切口中长出白色的毛状根，对照茎段只是长出一些 愈伤组织。感染茎段出现毛状根的时间较早，但诱导率与诱 导密度较低。 试验发现，侵染时间超过１５ ｍｉｎ时，发根的诱导率明显 降低，这说明在一定时间范围内，诱导率可以随侵染时间延长 而提高，但是超过阈值后，菌体和菌液对外植体的负面影响更 明显地体现出来，这种负面影响造成外植体死亡率的增加，最 经感染 未经感染 图ｌ 老瓜头叶片转化培养ｌ ５ ｄ后发根情况 终导致毛状根诱导率的降低 。不同浓度头孢噻肟钠除菌 效果不一，浓度达１ ０００ ｍｇ／Ｌ以上，对植物材料有影响，浓度 在６００ ｍｇ／Ｌ以下，除菌不易，８００ ｍｇ／Ｌ头孢噻肟钠是最适除 菌浓度。之后，逐步降低抗生素浓度，至完全除菌为止。 ３结论 在老瓜头离体根的再生试验中，ＮＡＡ适合于诱导老瓜头 离体根的再生，且带腋芽的茎段根的再生效果明显。在发根 经感染 未经感染 图２ 老瓜头茎段转化培养１ ０ ｄ后发根情况 农杆菌介导的老瓜头毛状根诱导过程中，用Ｄ ＝０．８的菌 液侵染叶片１５ ｒａｉｎ，共培养３ ｄ，８００ ｍｇ／Ｌ头孢噻肟钠除菌， ２．３ 老瓜头毛状根最适诱导条件的筛选 为最适诱导条件，而叶片是理想的遗传转化外植体。 将发根农杆菌菌液作适当稀释，侵染叶片、茎段一定时间 后共培养３ ｄ，除菌３０ ｄ后统计发根诱导率，结果见表２。由 参考文献： 表２可见，叶片和茎段发根诱导率随侵染时间和侵染菌液浓 ［１］祁利民，杨洁，贾建荣．宁夏野生植物老瓜头生物碱的化学成 度的变化而不断变化，Ｄ ＝０．８侵染１５ ｍｉｎ时，叶片、茎段 分研究［Ｊ］．宁夏医学院学报，２００２，２４（Ｓ）：３３６—３３９． 发根诱导率分别达１００％和４６．７％，诱导密度分别为４．６和 ［２］曲玲，曹有龙．牛心朴子的研究现状及综合利用［Ｊ］．甘肃农 ３．０，叶片发根诱导效果明显。Ｄ 。。 ＝０．８侵染１５ ｍｉｎ时，发 业科技，２００２（４）：４０—４２． 根诱导率与诱导密度均最高，为最佳配合。 （下转第９ｌ页） 江苏农业科学２０１０年第６期 一９１一 肖龙云，程嘉翎，王俊，等．铝胁迫下水稻幼苗对供氮形态的生理响应［Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（６）：９１—９３ 铝胁迫下水稻幼苗对供氮形态的生理响应 肖龙云 ，程嘉翎 ，王俊 ，李珊 ，田文超 （１．江苏科技大学生物与环境工程学院，江苏镇江２１２０１８；２．中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江２１２０１８） 摘要：在３种氮素形态及其配比（铵态氮／硝态氮的比例分别为１００：０、０：１００，５０：５０）的霍格兰营养液中添加 不同浓度的ＡＩＣＩ （２Ｏ、４０、６０ ｍｍｏｌ／Ｌ），研究铝胁迫下氮素形态对水稻幼苗生长及生理生化的影响，探讨铝毒防治措 施。研究结果，铝胁迫下水稻幼苗地上部可溶性蛋白质含量、叶绿素含量随着铝处理浓度的升高而减少，根系活力降 低，地上部丙二醛含量增加；株高、地上部和地下部干重、主根长度、根总体积均比对照减少。在２０～６０ ｍｍｏ￣Ｌ ＡＩＣＩ 处理范围内，水稻幼苗可溶性蛋白、叶绿素含量和根系活力均以铵态氮／硝态氮为５０：５０时最高，其次是铵态氮／硝态 氮为０：１００和１００：０；丙二醛则表现为铵态氮／硝态氮为５０：５０时最低，其次是铵态氮／硝态氮为０：１００和１００：０。 对水稻幼苗各项农艺性状进行了测定，表现为铵态氮／硝态氮为５Ｏ：５０时，铝胁迫下水稻幼苗的根系质量最好，株高 和干重最大。各项生理指标和相关农艺性状综合分析结果，铵态氮／硝态氮为５０：５０营养能缓解氯化铝对水稻幼苗 的毒害作用。 关键词：水稻幼苗；铝胁迫；氮素形态；生长；生理生化指标 中图分类号：￥５１１．０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１０）０６—００９１—０３ 土壤中过高的酸度是世界范围内农业生产普遍存在的问 题，它影响着全世界４０％可耕地上的植物生长“ 。我国土壤 １材料与方法 的酸化问题也较为严重 。铝毒害是酸性土壤上作物生长 １．１材料 最重要的因素之一 。铝对植物主要毒害症状为抑制 供试水稻品种为武育梗３号，购于南京中江种业股份有 根伸长、生长和引起根尖结构的破坏。铝毒最容易识别的症 限公司。 状是对根生长的抑制。铝毒害有短期反应和长期反应。短期 １．２铝胁迫处理 反应对植物体没有明显的影响，但已表现出根毛伸长受抑制。 水稻种子经０．１％的Ｈｇｃ１ 表面消毒１０ ｍｉｎ，经蒸馏水反 长期反应则表现出根伸长严重受抑制，根粗短，褐色，新叶变 复冲洗后，在３Ｏ℃的水中浸泡４８ ｈ，２５℃黑暗催芽。种子露 小卷曲，叶片脱落 。目前国内外关于铝对植物的影响主 白后播于装有石英砂的塑料花盆中，置于温室中培养。待出 要侧重于铝毒害和植物耐铝毒机理方面的研究 ］，将营养 苗后，幼苗分为３组，用含不同氮素形态３种配比（铵态氮／硝 作为缓解植物铝胁迫的重要途径的研究，报道较少。本 态氮的比例分别为１００：０、０：１００、５０：５０）的霍格兰营养液 试验以水稻为材料，在同一氮素水平不同氮素形态下，通过不 进行培养，并在３种霍格兰营养液中分别添加Ａ１ＣＩ ，调节营 同浓度铝处理，研究ＮＯ，一一Ｎ和ＮＨ 一Ｎ及其配比对水稻 养液Ａｌ“浓度分别为２０、４０、６０ ｍｍｏ￣Ｌ（营养液ｐＨ值为 幼苗生长的影响，以期为酸性土壤中缓解水稻铝胁迫提供理 ５．８），以不添加ＡＩＣ１ 为对照。每天处理幼苗２次，处理后第 论依据和技术支撑。 １５天进行采样测定各生理和生长指标。 １．３ 生理和生长指标测定 培养结束后，取下植株用蒸馏水洗净，分别测量株高、主 收稿日期：２０１０～０９—０１ 根长度、根体积和地上部干重、根系干重（１０５～１１０℃杀青 基金项目：江苏省高校自然科学基础研究面上项目（编号： ３０ ｒａｉｎ后，７０～８０℃烘至恒重，称重）。叶绿素含量测定采用 ０８ＫＪＢ５３０００２）。 乙醇萃取分光光度法 ，根系活力测定采用氯化三苯基四氮 作者简介：肖龙云（１９７７一），女，云南镇沅人，硕士，讲师，主要研究方 唑（Ｔ＇Ｉ＇Ｃ）法 ，丙二醛（ＭＤＡ）含量采用硫代巴比妥酸法 。， 向为植物营养生理生化。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｙｘｉａｏ５８＠１２６．ＯＯｍ。 可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法 。。 （上接第９０页） 传转化［Ｊ］．中草药，２００１，３２（１０）：９２４—９２６． ［３］周延清，张根发，苑宝军．发根农杆菌研究进展［Ｊ］．遗传，１９９６， ［７］燕飞，梁玉玲，崔东亚，等．发根农杆菌转化胀果甘草的研究 ｌ８（４）：４５—４８． ［Ｊ］．河北大学学报：自然科学版，２００４，２４（５）：５５—５８． ［４］曲玲，曹有龙．牛心朴子组织培养与快繁技术初步研究［Ｊ］． ［８］于数宏，李玲，刘传飞，等．发根农杆菌Ｒ１０００对野葛的遗传转 甘肃农业科技，２００２（４）：４２—４４． 化及其影响因素［Ｊ］．高科技通讯，２００２，ｌ２（３）：３４—３７． ［５］王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术［Ｍ］．北京：科学出 ［９］许铁峰，张汉明，张威，等．应用发根农杆菌Ｒｉ Ｔ—ＤＮＡ建立菘 版社，１９９８：２３８—２４３． 蓝的毛状根优质株系和植株再生系统『Ｊ］．第二军医大学学报， ［６］张汉明，许铁峰，ｒ如贤，等．发根农杆菌Ｔ—ＤＮＡ对墨旱莲的遗 ２０００，２１（１０）：９０７—９０９．
