碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110361440 A(43)申请公布日 2019.10.22

(21)申请号 201810309736.5(22)申请日 2018.04.09

(71)申请人 上海交通大学

地址 200240 上海市闵行区东川路800号(72)发明人 曹成喜　曹馨予　孔凡志　钟冉　

张强　肖华　(74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201

代理人 王毓理　王锡麟(51)Int.Cl.

G01N 27/447(2006.01)G01N 31/16(2006.01)

权利要求书2页 说明书3页 附图2页

()发明名称

碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法(57)摘要

一种碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法及装置，通过在碱性磷酸酶催化-电泳滴定系统中进行电泳滴定碱性磷酸酶标准品，获得不同活性碱性磷酸酶与对应的界面速度之间的标准曲线；然后在相同条件通过ALP-ET电泳滴定测定未知碱性磷酸酶活性的样品界面速度，通过对比ALP-ET标准曲线获得样品中ALP活性。本发明无需复杂的检测仪，简便易携带，能够在10分钟内通过少量样品分析直接用肉眼读出ALP活性。

CN 110361440 ACN 110361440 A

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1.一种碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法，其特征在于，通过在碱性磷酸酶催化-电泳滴定系统中进行电泳滴定碱性磷酸酶标准品，获得不同活性碱性磷酸酶与对应的界面速度之间的标准曲线；然后在相同条件通过ALP-ET电泳滴定测定未知碱性磷酸酶活性的样品界面速度，通过对比ALP-ET标准曲线获得样品中ALP活性；

所述的ALP-ET系统包括：ALP-ET芯片、检测电极、电源和LED紫外灯，其中：ALP-ET芯片包括：微通道以及位于微通道两端的阳极孔和阴极孔，所述的检测电极分别设置于阳极孔和阴极孔内，所述的微通道内设有凝胶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的ALP-ET芯片包括：依次设置于基座上的密封层和通道层，该通道层包括：阳极室、阴极室、可视刻度以及连接两室的通道。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，当所述的凝胶采用琼脂糖凝胶时，质量体积浓度为0.5％～2.5％；当所述的凝胶采用聚丙烯酰胺凝胶时，质量体积浓度为5.0％～25.0％，交联度为2.5％～7.5％。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征是，所述的凝胶内含酸性缓冲溶液与背景电解质的混合溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的阳极孔内含酸性缓冲液与背景电解质的混合溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的碱性磷酸酶催化是指：将将已知或未知活性的碱性磷酸酶、反应缓冲液、反应底物加入ALP-ET芯片的阴极孔中，在室温下孵育形成以下催化反应：

其中：4-MUP为4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐；[4-MU]-

为4-甲基伞形酮碱性盐，在紫外光照射下发出强烈蓝色荧光。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的电泳滴定是指：通过电源向阴极孔和阳极孔施加电场，阴极孔中的[4-MU]-在电场作用下向阳极移动，并与芯片微通道中的酸性缓冲液发生中和反应，生成无荧光的4-MU，从而形成荧光MRB界面：MRB界面的实验移动速度

该

其中：l1和l2分别为t1和t2时间内MRB界面移动的距离。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的反应缓冲液为碱性碳酸盐或Tris或二乙醇胺缓冲液；所述的反应底物和催化产物分别为4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐(4-MUP)和4-甲基伞形酮碱性盐([4-MU]-)。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的标准曲线是指：ALP的活性

即CALP＝a vMRB–b，其中：a和b分别为标准曲线的斜率

与截距，vMRB为荧光界面移动速度，单位为mm/min，Δten为ALP催化时间，；通过检测不同ALP标准品活性及其对应的MRB移动速度，测得斜率a和截距b，而获得ALP活性与MRB移动速度之间的标准曲线；MRB界面移动的理论速度

其中：vMRB为MRB界面移动速

分别为H+成

度(mm/min)，cMU和vMU分别为[4-MU]-的浓度(mol/L)和移动速度(m/s)，和

分浓度(mol/L)和成分移动速度(m/s)。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征是，所述的对比ALP-ET标准曲线是指：根据待测样品的MRB界面，通过CALP＝a vMRB–b获得待测血清样品的ALP活性，其中vMRB即为MRB移动速

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度V。

11.一种碱性磷酸酶-电泳滴定系统，其特征在于，包括：ALP-ET芯片、检测电极、电源和LED紫外灯，其中：ALP-ET芯片包括：微通道以及位于微通道两端的阳极孔和阴极孔，所述的检测电极分别设置于阳极孔和阴极孔内，所述的微通道内设有凝胶。

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碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法

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技术领域

[0001]本发明涉及的是一种生物检测领域的技术，具体是一种基于移动反应界面(Moving Reaction Boundary，MRB)电泳滴定(Electrophoresis Titration)的碱性磷酸酶活性便携式检测方法及装置。

背景技术

[0002]作为有机体中一种基础酶，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)催化多种底物(如核酸、蛋白质和生物碱)去磷酸化。常见的ALP活性检测方法有比色法、电化学法、化学发光法、电化学发光法和荧光法。这些检测方法一般基于仪器设备(如分光光度计、电化学传感器、荧光光度计)，具有稳定、灵敏、自动化、高通量等优点。但这些方法需要专用检测器、仪器体积庞大、设备昂贵，更无法实现便携式现场检测。发明内容

[0003]针对现有技术存在的仪器设备昂贵、体积庞大、无法实现便携式检测等的缺陷，本发明提出一种碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法及装置，无需复杂庞大的检测设备，能够在10分钟内通过少量样品分析直接用肉眼读出ALP活性。[0004]本发明是通过以下技术方案实现的：

[0005]本发明涉及一种碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法，通过在碱性磷酸酶催化-电泳滴定(ALP-ET)系统中进行电泳滴定碱性磷酸酶标准品，获得不同活性碱性磷酸酶与对应的界面速度之间的标准曲线；然后在相同条件下通过ALP-ET电泳滴定测定未知碱性磷酸酶活性的样品界面速度，通过对比ALP-ET标准曲线获得样品中ALP活性。[0006]所述的ALP-ET系统包括：ALP-ET芯片、阳极-阴极、电源和LED紫外灯，其中：ALP-ET芯片包括：微通道以及位于微通道两端的阳极孔和阴极孔，所述的阳极-阴极分别设置于阳极孔和阴极孔内，所述的微通道内设有凝胶。[0007]所述的阳极-阳极优选为铂电极。[0008]所述的电源优选为锂电池电源。

[0009]所述的凝胶采用但不限于脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等，优选当所述的凝胶采用琼脂糖凝胶时，质量体积浓度为0.5％～2.5％；当所述的凝胶采用聚丙烯酰胺凝胶时，质量体积浓度为5.0％～25.0％，交联度为2.5％～7.5％。

[0010]所述的凝胶内含酸性缓冲溶液与背景电解质的混合溶液。[0011]所述的阳极孔内含酸性缓冲液与背景电解质的混合溶液。[0012]所述的阳极孔、阴极孔和微通道中优选设有背景电解质溶液，该背景电解质溶液为氯化钠或氯化钾或其他中性盐，起着均匀导电作用，离子强度从5mmol/L到250mmol/L。[0013]所述的碱性磷酸酶标准品，即具有不同已知活性的碱性磷酸酶。[0014]所述的碱性磷酸酶催化是指：将已知或未知活性的碱性磷酸酶、反应缓冲液、反应底物加入ALP-ET芯片的阴极孔中，在室温下孵育形成以下催化反应：

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其中：4-MUP为4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐；[4-MU]-为4-甲基伞形酮碱性盐，在紫外光照射下发出强烈蓝色荧光。

[0015]所述的电泳滴定是指：通过电源向阴极孔和阳极孔施加电场，阴极孔中的[4-MU]-在电场作用下向阳极移动，并与芯片微通道中的酸性缓冲液发生中和反应，生成无荧光的4-MU，从而形成荧光MRB界面：

该MRB界面的实验移动速度

其中：l1和l2分别为t1和t2时间内MRB界面移动的距离。[0016]所述的孵育，时间为1到60分钟。[0017]所述的电场，强度为0.5V/mm～20V/mm。

[0018]所述的酸性缓冲液为Tris-HCl或者醋酸等酸性缓冲液，优选为：20mmol/L到250mmol/L的Tris-HCl酸性缓冲液(或者醋酸缓冲液等其他酸性缓冲液)与氯化钠(或者氯化钾等其他中性盐溶液)的混合溶液。

[0019]所述的反应缓冲液为碱性碳酸盐或Tris或二乙醇胺缓冲液，优选为：20mmol/L到250mmol/L的NaHCO3-Na2CO3(或者Tris缓冲液、二乙醇胺等其他碱性缓冲液)与氯化钠(或者氯化钾等其他中性盐溶液)的混合溶液。

[0020]所述的反应底物和催化产物分别为4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐(4-MUP)和4-甲基伞形酮碱性盐([4-MU]-)。

[0021]

所述的标准曲线是指：由于MRB界面移动的理论速度其中：

vMRB为MRB界面移动速度(mm/min)，cMU和vMU分别为[4-MU]-的浓度(mol/L)和移动速度(m/

s)，和分别为H+成分浓度(mol/L)和成分移动速度(m/s)；因此ALP的活性

其中：Ven为ALP催化反应体积，Δten为ALP催化时间，进而得到ALP

的活性

即CALP＝a vMRB–b，其中：a和b分别为标准曲

线的斜率与截距，通过检测不同ALP标准品活性及其对应的MRB移动速度，测得斜率a和截距b，而获得ALP活性与MRB移动速度之间的ALP-ET标准曲线。[0022]所述的对比ALP-ET标准曲线是指：根据待测样品的MRB界面速度，通过CALP＝a vMRB–b获得待测血清样品的ALP活性，其中vMRB即为MRB移动速度。[0023]所述的不同ALP标准品活性，优选为在ALP活性为1U/L到10U/L之间平均间隔选择适当的点。

[0024]所述的血清样品优选预先稀释10到100倍。

技术效果

[0025]与现有技术相比，本发明装置小巧、简单、便携，检测过程生成的荧光MRB清晰，可直接用肉眼读出ALP活性且检测限可达到0.1U/L；本发明ALP-ET方法无需昂贵检测仪器设备，成本极低；ALP催化过程可在5min内完成，ET芯片电泳滴定可在2min内完成，整个检测过程可控制在10min内；本发明特异性良好，样品中其他酶和蛋白的存在对ALP活性测量无明显影响，且ET芯片的测量结果与经典方法的测量结果无明显差异。附图说明

[0026]图1为本发明的ALP-ET原理示意图；

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图中：A为阴极孔中的ALP催化4-MUP产生[4-MU]-，在紫外光照射下发出蓝色荧光；

B为ALP催化后施加电场，[4-MU]-迁移进入微通道，与微通道内酸性缓冲液反应形成MRB，在不同时间内MRB的迁移距离不同；

[0028]图2为本发明的ALP-ET装置示意图；[0029]图中：A为施加电场前的整个装置，包括：ALP-ET芯片、阳极-阴极、电源和LED紫外灯；B为施加电场后在紫外光照射下的ALP-ET装置、及其MRB实际运行实验图；[0030]图3A和图3B分别为ALP-ET芯片设计图和实际组装图；[0031]图4为不同活性ALP(U/L)的MRB在1分钟内移动的距离；[0032]图5为MRB移动速度(VMRB)与ALP活性之间的标准曲线。

具体实施方式

[0033]如图1所示，为本实施例涉及的一种使用ALP-ET方法检测血清中ALP活性的方法，本实施例选择5个浓度点，为1.0、2.0、3.0、4.0、10.0U/L。[0034]如图1和图2所示，本实施例涉及的ALP-ET系统包括：ALP-ET芯片、阳极-阴极、电源以及用于荧光激发的紫外光源，其中：ALP-ET芯片包括：微通道、以及位于微通道两端的阳极孔和阴极孔，所述的阳极-阴极分别设置于阳极孔和阴极孔内，所述的微通道内设有凝胶。

[0035]如图3所示，所述的ALP-ET芯片包括：依次为密封层和通道层，其中：密封层为黑色或深色密封膜，通道层为透明高分子或玻璃材质，通过热塑或粘合将密封膜与通道层整合组成稳定的ALP-ET芯片。

[0036]所述的通道层包括：阳极孔、阴极孔、可视刻度以及连接两孔的通道，其中：刻度用来可视化读出中和界面的位移距离；其中通道层整体尺寸为35×35×10mm，每个通道尺寸为0.5×0.5×16mm。

[0037]本实施例测试具体步骤为：[0038]A、将1％琼脂糖凝胶(含有酸性缓冲液和背景电解质溶液)加热至完全溶解，注入芯片微通道中；[0039]B、将标准ALP(1.0～10.0U/L)、4-MUP、碳酸盐缓冲溶液以及背景电解质的混合溶液加入阴极孔中，室温下孵育5分钟，阳极孔中加入酸性Tris-HCl缓冲液(pH 6.0)与背景电解质的混合溶液；[0040]C、孵育后施加2V/mm的电场，打开紫外光源，带蓝色荧光的[4-MU]-分子向阳极移动，用手机拍摄记录下荧光MRB移动情况，如图4所示。[0041]D、由此分别测得不同活性ALP的MRB移动速度，计算出斜率a和截距b，从而得到标准曲线VMRB＝a*A+b，如图5所示，本实施例中a为0.033，b为3.872；[0042]E、由步骤A到D的相同方法重新测得未知浓度的血清样品，得到对应的MRB移动速度V，将其代入到步骤D中的标准曲线计算出ALP的活性，本实施例中，待测血清用碱性碳酸盐反应缓冲溶液稀释100倍。

[0043]上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

图5

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