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作为尿激酶抑制剂的

来源：爱go旅游网

[19]中华人民共和国国家知识产权局

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200680031728.4

[51]Int.CI.

A61K 31/155 (2006.01)A61K 31/425 (2006.01)C07D 271/07 (2006.01)A61P 35/00 (2006.01)

[43]公开日2009年3月4日[22]申请日2006.08.29[21]申请号200680031728.4

[30]优先权

[32]2005.08.29 [33]EP [31]05018732.7[86]国际申请PCT/EP2006/008451 2006.08.29[87]国际公布WO2007/025718 DE 2007.03.08[85]进入国家阶段日期

2008.02.29

[11]公开号CN 101378744A

[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标

事务所

代理人殷骏

[71]申请人威丽克斯股份公司

地址德国慕尼黑

[72]发明人S·斯佩尔 J·齐默曼 K·克驰

权利要求书 7 页说明书 13 页附图 15 页

[]发明名称

作为尿激酶抑制剂的二唑化合物

[57]摘要

本发明涉及用于抑制尿激酶－纤维蛋白溶酶原－激活剂(uPA)的具有较高生物利用率和口服给药性的新化合物，以及其作为治疗活性物质用于治疗与尿激酶或/和尿激酶－受体相关的疾病，例如肿瘤和转移的用途。本发明特别是涉及含有二唑基团的化合物。

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权利要求书

第1/7页

1.药物，其含有一种或多种通式I的化合物作为活性物质

其中

E表示以下基团，

200680031728.4权利要求书第2/7页

B表示-SO2-或-CO-， X表示-NR-或-CHR-， Z表示-R，-OR或-NH-R， Y表示-OR或-NHR，

R分别地表示-H，分支或直链的-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或者环状基团， R表示-H，-R，-COR，-COOR或-CON(R)2， R表示H或-O-R，

R表示-H，-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或-COR或-COOR，或者具有例如2-50个-C2-C4-烯氧基，例如乙烯氧基的低聚或多聚烯氧基，

R表示-H，-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或者环状基团，

R表示-H，分支或直链的-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或者环状基团，

R表示H，分支或直链的、线性的、单环、二环或多环的烷基，烯基，炔基，羧基烷基，羧基烯基，羧基炔基，芳基，杂芳基，羧基芳基，羧基烷基芳基，羧基杂芳基，-(CO)NRR或-COO-R，其中每个环状基团可以带有一个或多个取代基，例如选自-C1-C3-烷基，-OR(例如-OH或-C1-C3-烷氧基)，卤素，特别是Cl，＝O，-NO2，-CN，-COOR，-N(R)2，-NRCOR，-NRCON(R)2和-OCOR，并且其中每个烷基、烯基和炔基可以是直链或分支的，并且可以带有一个或多个取代基，例如选自卤素(F，Cl，Br，I)，-OR，-OCOR，-N(R)2，-NRCOR，COOR，-NRCON(R)2或者环状基团，其中，如果Y＝OH并且E表示Am或Gua，则R或R可以不是H，或者该化合物的盐以及任选药学常见的载体、稀释剂或/和助剂。 2.根据权利要求1的药物，其特征在于，其含有一种或多种通式

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200680031728.4权利要求书第3/7页

II的化合物

其中

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X，Y，R，R和R如权利要求1中的定义，或者该化合物的盐。

3.根据权利要求1或2的药物，其中R表示

R表示或

4.根据权利要求1或2的药物，其中R表示取代或未取代的C1-C3-烷基-芳基-基团，特别是苄基，其任选地可以在间位或对位经卤素或/和-NO2取代，其中卤素选自F、Cl、Br和I。

5.根据权利要求1至4之一的药物，其中所述化合物选自

200680031728.4权利要求书第4/7页

或其盐。

6.根据权利要求1至5之一的药物，其特征在于，其是可口服给药的药剂。

7.根据权利要求1至6之一的药物的用途，用于制备用来防治与尿激酶和/或尿激酶受体病理学过表达相关的疾病的药物组合物。

200680031728.4权利要求书第5/7页

8.根据权利要求7的用途，用于肿瘤治疗或预防。

9.根据权利要求8的用途，用于治疗或预防转移灶形成。 10.根据权利要求9的用途，用于治疗原发性肿瘤。 11.根据权利要求7至10之一的用途，其中制备可口服给药的组合物。

12.根据权利要求7至11之一的用途，其中所述组合物以片剂、糖衣剂、胶囊、丸剂、溶液、乳液或/和悬浮液的形式制得。 13.式I的化合物

其中E、B、X、Z、Y和R如权利要求1中的定义。 14.式II的化合物

其中X、Y、R、R和R如权利要求1中的定义。6

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200680031728.4权利要求书第6/7页

15.根据权利要求13或14的化合物，选自

或其盐。

16.通过给予有效量的至少一种根据权利要求13至15之一的化

200680031728.4权利要求书第7/7页

合物而对生物进行尿激酶抑制的方法。

17.通过给予有效量的根据权利要求13至15之一的至少一种化合物而对人进行尿激酶抑制的方法。

18.根据权利要求13至15之一的化合物作为前药的用途。

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说明书

第1/13页

作为尿激酶抑制剂的二唑化合物

本发明涉及用于抑制尿激酶-纤维蛋白溶酶原-激活剂(uPA)的具有较高生物利用率和口服给药性的新化合物，以及其作为治疗活性物质用于治疗与尿激酶或/和尿激酶-受体有关的疾病，例如肿瘤和转移灶的用途。本发明特别是涉及含有噁二唑基团的化合物。尿激酶型的纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)在肿瘤侵袭和转移灶形成中扮演关键角色(Schmitt等人，J.Obst.Gyn.21(1995)，151-165)。uPA在多种不同种类的肿瘤细胞中表达(Kwaan，CancerMetastasis Rev.11(1992)，291-311)，并结合在与肿瘤相关的uPA-受体(uPAR)上，在那，纤维蛋白溶酶原被激活成纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶能够分解细胞外基质(ECM)的不同组分，如纤连蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原蛋白。其还激活几种其它的ECM分解性酶，特别是基质-金属蛋白酶。高量的与肿瘤相关的uPA与癌患者较高的转移危险相关(Harbeck等人，Cancer Research 62(2002)，4617-4622)。因此，抑制uPA的蛋白分解活性是抗转移疗法的良好出发点。几种活性和选择性的尿激酶抑制剂已有描述。例如，EP1098651中公开了苯甲脒型的uPA抑制剂，WO 01/96286和WO 02/14349中公开了芳基胍型的uPA抑制剂。这些合成的抑制剂的共同特征是由脒基或/和胍基组成的碱性基团。

不过，已知的尿激酶抑制剂具有以下缺点，其在口服使用时吸收较差，因此在这种施用类型下在体内只能产生较小的药理学作用。因此，多数情况下每周一次，不过至多两次经数小时时间间隔将药剂静脉内向患者给药。这与患者的高负担相关联，因为这与大量的时间消耗和频繁的就诊相关联，并且以患者较高程度的合作为前提。此外，在静脉内施用的情况下存在感染的危险，特别是在血管旁(paravasal)出现的浸出物(Infusat)会发生强烈的局部炎症，直

200680031728.4说明书第2/13页

至组织坏死，这需要漫长的后续治疗和观察。

肌内和皮下施用途径也不提供优点，因为在此情况下在刺入点经常会出现剧痛以及发生炎症直至组织坏死，这同样需要漫长的后续治疗。

如已经阐述的，含有脒和胍的尿激酶抑制剂在口服施用时仅表现出很小的药理学作用。活性物质治疗效果的前提条件是其生物利用率。因此在口服给药后必须从胃肠道吸收。这种膜透入的重要机理是被动扩散(GangvarS.等，DDT(1997)148-155)。该文献部分认为，活性物质的亲脂性对于通过胃肠道膜屏障的被动扩散扮演重要角色。因此，在EP07080中描述了用于抗肠虫病作用的五脒，其将脒官能改性成偕胺肟、偕胺肟酯和噁二唑，其中优选偕胺肟酯和噁二唑用作为合适的改性。

不过，另一方面表明，亲脂性程度单独是不够的(Hansch等人，J.Am.Chem.Soc.86(19)1616-1626)，并且化合物亲脂性的提高不是预言膜透入的合适参数。这样，不能确定亲脂性和膜渗透之间的直接关系(Conradi等人，Pharm.Res.9(1992)435-439)。因此，亲脂性的提高在个别情况下可以提高膜渗透，然而并非必然地造成提高的口服生物利用率。因此，对阿加曲班而言，碱性基团转变成偕胺肟作为前药导致渗透能力改善，但还额外地导致活性损失(Rewinkel，Adang Cur.Pharm.Design 5(1999)1043-1075)。因此不能不加考虑地预见，是否和怎样的改性可以改善一种活性物质在胃肠道中的膜透入。更少地可预见，所述改性对活性物质的药性会有怎样的影响。

本发明的目的是提供用于抑制尿激酶的新药物，其在口服给药时在有机体内具有明显提高的生物利用率和活性。

根据本发明，该目的是通过一种药物实现的，所述药物含有一种或多种通式I的化合物作为活性物质

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其中

E表示以下基团，

B表示-SO2 X表示-NR1-或-CO-，

-或-CHR1

-，

说明书第3/13页

200680031728.4说明书第4/13页

Z表示-R，-OR或-NH-R， Y表示-OR或-NHR，

R表示-H，-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或-COR或-COOR，或者具有例如2-50个-C2-C4-烯氧基，例如乙烯氧基的低聚或多聚烯氧基，

R表示-H，-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或者环状基团，

R表示-H，分支或直链的-C1-C6-烷基，-C2-C6-烯基或-C2-C6-炔基，未经取代或经取代的，或者环状基团，

R表示H，分支的或直链的、线性的、单环、二环或多环的烷基，烯基，炔基，羧基烷基，羧基烯基，羧基炔基，芳基，杂芳基，羧基芳基，羧基烷基芳基，羧基杂芳基，-(CO)NRR或-COO-R，其中每个环状基团可以带有一个或多个取代基，例如选自-C1-C3-烷基，-OR(例如-OH或-C1-C3-烷氧基)，卤素，特别是Cl，＝O，-NO2，-CN，-COOR，-N(R)2，-NRCOR，-NRCON(R)2和-OCOR，并且其中每个烷基、烯基和炔基可以是直链或分支的，并且可以带有一个或多个取代基，例如选自卤素(F，Cl，Br，I)，-OR，-OCOR，-N(R)2，-NRCOR，COOR，-NRCON(R)2或者环状基团，其中，如果Y＝OH并且E表示Am或Gua，则R或R可以不是H，或者该化合物的盐以及任选药学常见的载体、稀释剂或/和助剂。优选该药物是可口服给药的药剂。特别优选该药物用于抑制尿激酶-纤维蛋白溶酶原激活剂。优选通式II的化合物

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200680031728.4说明书第5/13页

其中

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X，Y，R，R和R如上定义，或者其盐。

基团E优选存在于化合物I和II的苯基环的对位。特别优选其中E表示N-Oxa或Oxa的通式I化合物。

在一种实施方式中，本发明的化合物具有噁二唑基团。令人惊讶地发现，这种化合物是特别可口服使用的。

在另一种优选的实施方式中，本发明的化合物在位置Y以及R或7

R具有至少一个酯，更优选两个酯基团化。化合物，其在丝氨酸基上和/或在基团E上，特别是在脒、胍或噁二唑基团化上具有酯基团，在高口服利用率的同时令人惊讶地表现出高的效果。

所述化合物可以以盐，优选以生理相容性酸的盐，例如无机酸的盐，特别优选以盐酸盐或者以合适的有机酸的盐存在。所述化合物可以以光学纯的化合物或者以对映体或/和非对映体的混合物存在。环状基团可以含有一个或多个饱和、不饱和或芳族环。环状基团优选的实例是环烷基，芳基，烷基芳基，杂芳基和二环基团。特别优选单环或二环基团。环状基团含有优选4至30个，特别是5-10碳原子和杂原子作为环原子，以及任选一个或多个如上所述的取代基。杂

200680031728.4说明书第6/13页

环体系优选含有一个或多个O、S或/和N原子。优选的二环的环体系是具有-CO-基团的那些。环状基团最优选的实例是金刚烷基或苄基。烷基、烯基和炔基优选含有至多6个，特别是至多4个碳原子。R优选是H或任选地经取代的C1-C4-烷基，例如-CH3或C1-C6-烷基芳基，以致可以是CO-X-NR，例如甘氨酰基、丙氨酰基、苯丙氨酰基或高苯丙氨酰基(Homophenylalanylrest)。在基团化X中，R特别优选是CH3，以致X表示-CH(CH3)-。

R特别优选是COR，以致Y表示酯基团。在基团化Y中，R特别优选表示分支的烷基，特别是表示叔丁基。

R特别优选是-O-R，其中R又优选表示-COR，因此基团化R优选包含酯基团。在此R还优选表示分支的烷基，特别是表示叔丁基。此外，R优选表示环状基团，特别是表示金刚烷基。

R特别优选是对氯苄基(Cl-C6H5-CH2-)。R优选是-H或C1-C3-烷基，特别是CH3。

还优选其中结构单元Z表示R的化合物，其中R表示具有环状取代基，例如任选地经取代的苯基或二环基团的烷基，比如

或

特别优选的化合物是这样的，其中R表示经取代或未经取代的C1-C3-烷基-芳基-基团，例如苄基，其任选地可以在间位或对位经卤素或/和-NO2取代，其中卤素选自F、Cl、Br和I，特别优选Cl和Br。最优选表I中所示的化合物和WX-711和WX-781以及它们的盐。只要这里没有其它定义，则合适的取代基分别是卤素(特别是F，Cl，Br或I)，C1-C4-烷基，OR(特别是OH，OCOR，COOR，N(R)2，NRCOR6或NRCON(R)2)。

本发明的化合物可以任选地与合适的药学助剂或载体物质一起用

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200680031728.4说明书第7/13页

于制备药物。在此可以与其它活性物质(例如其它尿激酶抑制剂，比如抗体和/或肽)组合给药，也可以与化疗药物和细胞生长抑制剂或/和抑制细胞生长的活性物质组合给药。

通式I和/或II的本发明化合物同样也可以以前药方式进行使用和应用。

更一般而言，前药是相应的药学活性物质的药学非活性衍生物，其在口服给药后自发或酶促地转换或转变而释放药学有效的物质。所述药物对人和动物可以局部、直肠或肠胃外，例如静脉内，皮下，肌内，腹腔内，舌下，经鼻或/和吸入给药，剂型例如为片剂，糖衣剂，胶囊，丸剂，栓剂，溶液，乳液，悬浮液，脂质小体，吸入喷剂或透皮体系，如膏药，特别优选口服，例如作为缓释/延迟配方给药。本发明化合物适于防治与uPA或/和尿激酶-纤维蛋白溶酶原-激活剂受体(uPAR)的病理学过表达相关的疾病。它们例如能够高效抑制恶性肿瘤的生长或/和扩散以及肿瘤的转移。这方面的实例是肿瘤疾病，例如乳癌，肺癌，膀胱癌，胃癌，宫颈癌，卵巢癌，肾癌，前列腺癌和软组织肉瘤，特别是与高转移率相关的肿瘤。在此，所述化合物任选地可以与其它肿瘤药剂或者与其它治疗方式，例如辐射或/和外科手术一起使用。

此外，本发明的化合物对于其它与uPA相关或/和uPAR相关的疾病也是有效的。这类疾病的实例比如肺动脉高血压和/或心脏病(例如WO 02/00248)，胃和肠疾病，比如炎性肠病，恶化前的结肠腺瘤(Colonadenome)，炎性疾病，比如脓毒性关节炎，骨关节炎，类风湿性关节炎，或其它疾病，如骨质疏松，胆脂瘤，皮肤和眼病以及病毒或细菌感染，在此明确涉及到在EP-A-0 691 350，EP-A-1 182 207和US-专利5,712,291中提及的疾病。

通式I的化合物例如可以如图1中的合成示意图那样来制备。令人惊讶地发现，本发明的uPA抑制剂不仅具有改善的生物利用率，而且对原发性肿瘤还具有明显改善的活性。

本发明的物质可以单独使用或与其它有生理作用的物质组合使

200680031728.4说明书第8/13页

用，例如与放疗药或与细胞毒性或/和抑制细胞生长的药剂，例如化疗药，比如顺铂，阿霉素，5-氟尿嘧啶，紫杉酚衍生物，或/和其余的化疗试剂，例如选自烷基化的试剂，抗代谢物，抗生素，表叶毒素和长春花-生物碱，组合使用。同样可以与辐射疗法或/和外科手术组合。通过本发明，通过给药有效量的至少一种通式I化合物来提供一种对生物(特别是人)抑制尿激酶的方法。待给药的剂量取决于待治疗的疾病的种类和严重程度。例如日剂量为0.01-100mg/kg活性物质。最后，本发明涉及通式I的尿激酶-纤维蛋白溶酶原-激活剂的新抑制剂。

通过以下的图和实施例更详细地解释本发明。图1展示WX-770的合成示意图和衍生物的合成。图2展示WX-770在大鼠中的口服利用率。图3展示WX-770体外代谢激活成WX582。

图4展示本发明化合物WX770在BN-472-大鼠-肿瘤模型中的有效性。

图5展示转化成噁二唑。

图6展示用大豆磷脂酰胆碱(对照物)，皮下给药WX-340以及口服给药WX-771(图6A)以及WX-781(图6B)以及WX-780(图6C)，剂量为0.2mg/kg或2mg/kg，进行治疗的肿瘤生长动力学。图7展示对原发性肿瘤尺寸和重量的影响。图8展示抗转移效果。图9展示对有机体重量的影响。实施例1:WX-770的合成

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Boc-N-Me-Ala-4-硝基苯甲酰胺(1)

向Boc-N-甲基-L-丙氨酸(30.00g，147.8mmol)在干燥四氢呋喃(980mL)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(23.77g，206.7mmol)和N，N′-二环己基碳二亚胺(33.10g，160.7mmol)，并在室温下搅拌1.5h。然后加入4-硝基苄胺(22.78g，149.9mmol；从盐酸盐通过用碱液处理得到)，使反应物(Ansatz)搅拌过夜(DC对照物:CHCl3/MeOH5:1)。将不溶物过滤掉，固体用THF洗涤，并浓缩滤液。残留物通过在硅胶上用氯仿/甲醇99:1进行层析而纯化，得到作为固体的1(52.8g，quant.)。

N-Me-Ala-4-硝基苯甲酰胺盐酸盐(2)

在-78℃下，向1(51.90g，153.8mmol)在乙酸乙酯(1.5L)的溶液中加入氯化氢在乙酸乙酯(1.5L)中的饱和溶液，并在解冻的冷浴中搅拌过夜(DC-对照物:CHCl3/MeOH5:1)。使氮气导入该溶液一段时间，以便排掉过量的氯化氢。然后浓缩至干燥，并用乙醚浸渍残留物，将固体过滤掉，并干燥(30.48g，83％)。 4-氯苄基磺酰氯(3)

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化合物3由4-氯苄基氯制得。首先通过传统的格氏反应由其制备4-氯苄基-溴化镁，然后在强烈放热反应中与硫酰氯反应，根据:Bhattacharya，S.N.；Eaborn，C；Walton，D.R.M.J.Chem.Soc.1968，1265-1267。该产物至少以较少的量也可购得。 (4-氯苄基磺酰基)-D-Ser(O-tBu)-OH(5)

在氩气下将O-叔丁基-D-丝氨酸(16.30g，101.2mmol)悬浮于干燥二氯甲烷(150mL)中，加入三乙胺(20.45g，202.5mmol)，然后在强力搅拌下滴加三甲基氯硅烷(21.87g，202.5mmol)。观察到轻微的升温，接下来将该混合物加热至回流1.5h。在冰冷却下向3的澄清溶液中加入氯苄基磺酰氯(4，19.36g，86.1mmol)，在升温的冷浴中搅拌过夜(DC-对照物:CHCl3/MeOH5:1)。使反应物真空浓缩，残留物吸收在乙醚中。用5％的碳酸氢钠溶液多次萃取，用1M硫酸使合并的水相达到pH2，用乙酸乙酯萃取产物，合并的有机相被干燥(MgSO4)和浓缩(28.65g，80％)。

(4-氯苄基磺酰基)-D-Ser(O-tBu)-Cl (6)

向5(15.60g，44.7mmol)在干燥二氯甲烷(425mL)的溶液中加入亚硫酰氯(10.55g，.4mmol)和干燥DMF(1.1mL)，并在室温下搅拌3h(GC-对照物)。将溶剂排出，没有进一步纯化即使用该粗制的酰氯6(17.00g，quant.)。

(4-氯苄基磺酰基)-D-Ser(0-tBu)-N-Me-Ala-4-硝基苯甲酰胺(7) 向2(12.24g，44.7mmol)在干燥二氯甲烷(150mL)中的溶液中加入二异丙基乙基胺(11.g，.5mmol)，并搅拌，直到形成澄清溶液。在冰冷却下滴加6(16.46g，44.7mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液，并在室温下搅拌2h(DC-对照物:CHCl3/MeOH 9:1)。用5％硫酸氢钾溶液和5％碳酸氢钠溶液洗涤该有机溶液，干燥(MgSO4)并浓缩。残留物用戊烷/乙酸乙酯3:2在硅胶上进行层析。得到无色固体的7(14.73g，58％)。

(4-氯苄基磺酰基)-D-Ser-N-Me-Ala-4-硝基苯甲酰胺(8) 7(14.70g，25.8mmol)在三氟乙酸(260mL)中的溶液与苯硫基甲

200680031728.4说明书第11/13页

烷(3.20g，25.8mmol)混合，并在室温下搅拌过夜(DC-对照物:CHCl3/MeOH 5:1)。反应物在真空和高真空中浓缩。粗制产物通过用CHCl3->CHCl3/MeOH 5:1在硅胶上柱层析而纯化(产率10.37g，78％)。 (4-氯苄基磺酰基)-D-Ser-N-Me-Ala-4-氨基苯甲酰胺盐酸盐(9HCl)

向8(5.00g，9.8mmol)在甲醇(50mL)的溶液中加入10％钯/炭(湿的，含有50％水；0.50g)，并氢化过夜(氢气球)。3h后再加一次催化剂(0.05g)(DC对照物:CHCl3/MeOH 5:1)。将催化剂过滤掉，用甲醇洗涤，将滤液浓缩至干燥。

游离胺9(3.86g，7.9mmol)在冰冷却下悬浮于4M氯化氢的二噁烷(7.8mL)溶液中，然后加入甲醇(10mL)，直到产生澄清溶液。30min后，在冰冷却下再加一次4M HCl的二噁烷(7.8mL)溶液，并在0℃下再搅拌1h。将反应溶液浓缩，并且固体在真空中干燥(4.19g，82％)。 (4-氯苄基磺酰基)-D-Ser-N-Me-Ala-4-(N-氰基氨基)-苯甲酰胺(10)

向9(HCl-盐)(3.96g，7.6mmol)在干燥乙醇(60mL)的溶液中加入无水、真空加热的乙酸钠(1.53g，19.1mmol)。悬浮液与溴化氰(0.88g，8.4mmol)在干燥乙醇(30mL)中的溶液混合，并在室温下搅拌过夜。反应产物在冰浴中冷却，抽吸不溶物，残留物用少量乙醇洗涤，并浓缩滤液。残留物在硅胶上用氯仿/甲醇9:1进行层析纯化(1.90g，49％)。

(4-氯苄基磺酰基)-D-Ser-N-Me-Ala-4-(N-羟基胍基)-苯甲酰胺(11)

在冰冷却下，向12(1.90g，3.7mmol)在干燥乙醇(38mL)中的溶液中混入羟基胺盐酸盐(0.26g，3.7mmol)和乙基二异丙基胺(0.48g，3.7mmol)，并在室温下搅拌过夜。第二天再加一次0.2摩尔当量的羟基胺盐酸盐和乙基二异丙基胺。24h后将反应产物浓缩，残留物在硅胶上用氯仿/甲醇9:1->5:1(含有1％乙酸)进行层析。将产物级份浓缩，最后的剩余物乙酸用甲苯共蒸馏除去。将残留物悬浮在乙醚和四氢呋喃

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的混合物中并充分搅拌。抽吸固体，并真空干燥(1.0g，50％)。 (4-氯苄基磺酰基)-D-Ser(CO-t-Bu)-N-Me-Ala-4-(N-叔丁基羰基氧基胍基)-苯甲酰胺(12，WX-770)

向200mg11(0.37mmol)在2ml NMP和2ml新戊酸中的溶液中加入5当量新戊酰氯(228μl；1.85mmol)，并在RT下搅拌过周末。在此形成由约60％产物、20％原料和20％分别被新戊酸酯单取代的原料所组成的混合物。再加入5当量新戊酰氯后，反应在又过2天后中断。根据HPLC，形成了较高纯度的产物。反应混合物用20ml乙酸乙酯稀释，并用每次20ml 5％ NaHCO3萃取三次和用浓NaCl-Lsg.萃取一次。有机相在Na2SO4上干燥，溶剂在旋转蒸发器上抽除。所得的油状物溶于5ml二氯甲烷中，在搅拌下缓慢滴入50ml二异丙基醚中。使絮状沉淀在冰箱中进一步结晶，离心分离，并在高真空中干燥。产率为115mg(0.16mmol；44％)。

WX-771，WX-780以及WX-781的抗肿瘤效果和抗转移效果尿激酶型(uPA)的纤维蛋白溶酶原-激活剂，其细胞受体(uPAR)和其抑制剂(PAI-1)是纤维蛋白溶酶激活级联的主要组分。纤维蛋白溶酶在组织改造和在细胞迁移过程，以及通过激活其它酶(例如基质金属蛋白酶(MMPs))在与肿瘤相关的蛋白分解活性中扮演重要角色。这样，例如在乳癌情况下，这些成分高的表达率促进肿瘤的侵袭、转移扩散和新血管生成。因此，抑制与肿瘤相关的蛋白分解活性是开发用于癌症患者的抗肿瘤或抗转移活性物质的新思路。

进行试验来研究WX-771、WX-780以及WX-781的抗肿瘤效果和抗转移效果。

使用褐色的挪威大鼠中的BN-472转移性乳肿瘤作为测试体系。所使用的肿瘤组织类型例如在Kort等人，J.Natl.Cancer Inst.72(1984)709-713中有描述。大鼠采用Harlan Nederland，NL5960-ADHorst，The Netherlands，是六到八周龄，且128g至170g重。固体物质

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WX-340:

为了比较的目的，共同研究(4-氯-苄基磺酰基-D-Ser-Gly-4-胍基-苯甲酰胺盐酸盐)，其皮下注射情况下的抗肿瘤和抗转移效果是已知的。为了给药，将0.75mg WX-340溶于20ml5％重量/体积D-甘露醇(Manitol)水溶液中，并通过皮下注射以剂量0.2mg活性物质/kg大鼠进行给药。对照物:

作为对照物，给药磷脂酰胆碱载体，是通过将400mg大豆磷脂酰胆碱加入20ml磷酸盐缓冲的盐溶液和400μl无水乙醇中而得到的。该悬浮液的0.8ml作为对照物向大鼠口服给药。 WX-771:

将7.5mg WX-771加入20ml也用作对照物的大豆-磷脂酰胆碱溶液中。为了使给药为2mg/kg，口服给药0.8ml所述悬浮液。对于第二组，将该储备溶液以1:10稀释，从而实现在同样给药0.8ml/大鼠时，剂量为0.2mg/kg。 WX-780:

将7.5mg WX-780加入20ml相应于上述对照物悬浮液的大豆-磷脂酰胆碱悬浮液中。为了使给药剂量为2mg/kg，向大鼠给药0.8ml所述悬浮液。为了使给药剂量为0.2mg/kg，将该储备溶液以1:10稀释，在此另外给药0.8ml/大鼠。 WX-781:

将7.5mg WX-781加入20ml相应于上述对照物悬浮液的大豆-磷脂酰胆碱悬浮液中。为了使给药剂量为2mg/kg，向大鼠口服给药0.8ml。为了使给药剂量为0.2mg/kg，将该储备溶液以1:10稀释，在此另外口服给药0.8ml/大鼠。结果:

研究表明，WX-771、WX-780以及WX-781在日剂量单位为0.2或2mg/kg口服给药达三周情况下表现出明显的抗肿瘤和抗转移作用。结果表示在图6至9中。

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图2

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图3

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图4

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图6A

图6B

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图6C

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图7

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图7(续)

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图8

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图8(续)

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图9

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图9(续)

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