1. （1）一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。
（2）然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。
2.
（1）对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。
（2）对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。
（3）对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。
（4）对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。
（5）对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。
（6）对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。
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第一节标本采集与运送
一、标本的采集
1. 采样时间：尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。
2. 标本种类的选择：根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。
常见分离病毒标本的选择：
3．常见标本的采集方法
(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。
(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。
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(3) 宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离 HSV、CMV。
(4) 粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。
(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。
(6) 喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。
(7) 尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用于分离CMV和HSV。
(8) 尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。
二、标本的运送和保存
1. 病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，4℃下数ｈ或-70℃。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。
2. 病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml，为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。
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第二节 病毒分离与鉴定
一、病毒的分离方法
1. 组织细胞培养 根据细胞的来源、特性和传代次数分为：
(1) 原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成的单层细胞，称之为原代细胞。
(2) 二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。
(3) 传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。
2．鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。
3．动物接种 动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。
常用于病毒分离的细胞
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二、病毒的鉴定： 必须通过全面了解其特性才能得到鉴定。
1. 根据临床特点，流行病学资料，标本来源，大致了解病毒的一些特性，有助于确认病毒的种类。
2. 动物感染范围及特点 病毒感染动物的范围、发病的潜伏期。
3. 细胞培养特点。
综合上述1/2/3资料作出鉴定。
4. 病毒鉴定的方法
（1）细胞培养的结果观察：
病毒增殖后导致细胞发生：
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①细胞病变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；
②不出现细胞病变现象。
③细胞培养液pH的变化。
（2）中和试验：
病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒。
用于病毒的分型诊断最具敏感和准确性。也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。
（3）空斑或蚀斑形成试验：
空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。
（4）干扰现象：
某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。
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（5）红细胞吸附及吸附抑制试验：
正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。
可作为初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。
（6）血凝试验及血凝抑制试验：
某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型别确定的依据。
（7）病毒的大小及形态：可用电子显微镜观察病毒的大小及形态。
（8）核酸类型鉴别及序列测定：
利用5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。
对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或 DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。
（9）耐酸试验：肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。
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（10）乙醚敏感试验：
病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。
（11）免疫荧光抗体染色：
将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标记染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确定型别。
第三节病毒感染快速诊断
通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。
一、形态学检查
1．光学显微镜
观察病毒感染细胞出现的包涵体。根据特点可作出辅助诊断。狂犬病病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体。巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体。
2．电子显微镜检查
(1) 电镜直接检查：早期病毒感染标本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿粪便中的轮状
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病毒、甲肝患者粪便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液，HBV患者血清，均可观察到特征性病毒颗粒。
(2) 免疫电镜检查：在标本中加入抗体。使病毒聚集成块负染观察，更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍。
二、病毒抗原检测：病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。
1．免疫荧光技术：
适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。
2．酶免疫技术：
有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗体等。
3.其他技术：如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。
三、早期抗体检测
检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快速明确诊断各
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种病毒引起的新生儿先天性感染，测定HAV感染后抗HAV的IgM抗体可以明确诊断HA等。
四、病毒核酸检测：只要有完整的特异基因片段存在，就可进行诊断。
1．斑点杂交法
将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。
2．固相杂交技术
将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。
3.原位分子杂交技术
在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。
4.Southern印迹和Northern印迹法
Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒
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DNA特异序列。
Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。
5．聚合酶链反应(PCR)
(1) DNA病毒：可直接进行PCR扩增其特异片段。
(2) RNA病毒：可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增。
(3) 定量PCR技术：对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。
6．病毒核酸的直接检测
有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察其特有的11个核酸节段的条带排列情况，进行诊断。
五、病毒检验的结果评价
通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。
通过分离和鉴定获得致病性病毒，发现病毒感染的特异征象，如机体内产生特异性抗
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体,急性期和恢复期血清中相应的特异性抗体有4倍以上的升高，细胞内包涵体的形成等,就可得出病原学诊断。
感染病毒的临床意义必须结合流行病学资料、临床表现、病毒种类及机体的病理变化作综合分析，才能判定。
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